Revista internacional de minería de datos biomédicos
Acceso abierto
ISSN: 2090-4924
ISSN: 2090-4924
Shailasree S
Abstracto
Los estudios de vía de toxicidad por datos, especialmente el sistema ascendente de reacciones que ocurren en las células recompensadas con veneno antes de que se tenga en cuenta su muerte celular personalizada, brindan una manera imparcial de lidiar con los cambios de relajación que eligen el destino final del teléfono. Examinamos el impacto del citotóxico, la miricitrina, mediante un enfoque transcriptómico, proteómico y metabolómico combinado en los ajustes celulares tras la introducción del citotóxico. transcriptomaLos cambios que ocurrieron antes de que la célula pasara a la introducción de miricitrina mediante conjuntos de prueba destacaron enfáticamente los cambios en el grupo identificados con cualidades con un papel en la solidez cromosómica, por ejemplo, la ribonucleoproteína atómica heterogénea (HNRNPM), que se reguló a la baja. Aquellos involucrados con la digestión versátil del carbono, por ejemplo, la argininosuccinato sintasa (ASS1) se regularon positivamente y se identificaron como una reacción intermedia al presentarse al veneno. El ATP intracelular y la verticalidad mitocondrial todavía estaban cerca de los niveles de control a las 18 a 24 h de las células N2aexpuestos a citotóxicos, con cambios en el metaboloma articulado. Se identificaron niveles de glucosa modificados y presión oxidativa (disposición de sulfóxido de metionina) a medida que cambiaba la digestión de energía. El uso de fosfocreatina y una acumulación equivalente de creatina demostraron fatiga en la cuna de la vitalidad celular. Se observó el trabajo inconfundible de GSH para contrarrestar el estrés celular en expansión como un ajuste temprano antes de la ruptura de la homeostasis celular. La información directa que prueba la muerte celular por apoptosis con p38 mapa quinasa intercedida por p53 promulgó la regulación positiva de caspasa 3 se explica y se examinará.
Introducción
El neuroblastoma es el tumor fuerte extracraneal más conocido en la adolescencia. Con mucho, la mayoría de los pacientes en estadio metastásico (M) presentan células tumorales dispersas (DTC) en la médula ósea (BM) al final y al retroceso. A pesar de que estas células representan un elemento disuasorio significativo en el tratamiento de pacientes con neuroblastoma, los datos sobre su perfil de comportamiento se mantuvieron sutiles. La presente investigación de RNA???Seq de tumores esenciales en etapa 4/M, mejoró los DTC demostrativos y de retroceso derivados de BM, al igual que las células mononucleares derivadas de BM relacionadas.(MNC) de 53 pacientes descubrieron 322 cualidades comunicadas diferencialmente en DTC cuando se contrastaron con los tumores (q < 0.001, |log2FC|>2). Especialmente, los niveles de registros codificados por el ADN mitocondrial aumentaron en los DTC, aunque, por ejemplo, las cualidades asociadas con la angiogénesis se regularon a la baja. Además, 224 cualidades se comunicaron excepcionalmente en DTC y solo un poco, si de alguna manera, en MNC (q < 8 × 10−75 log2FC> 6). Sorprendentemente, encontramos el transcriptomade los DTC de retroceso generalmente se asemejan a los de los DTC indicativos con solo 113 cualidades comunicadas diferencialmente bajo cortes flexibles (q < 0.01, |log2FC|>0.5). Sorprendentemente, los DTC de retroceso indicaron una mejora posicional de 31 cualidades reguladas a la baja en el cromosoma 19, incluidas cinco cualidades silenciadoras de tumores: SIRT6, BBC3/PUMA, STK11, CADM4 y GLTSCR2. Este primer examen de RNA???Seq de los DTC de neuroblastoma descubrió su perfil de articulación único en su tipo en contraste con los tumores y las MNC, y contrastes menos articulados entre los DTC sintomáticos y de retroceso.
El último influyó especialmente en la regulación a la baja de las cualidades codificadas por el cromosoma 19. Dado que estos cambios pueden estar relacionados con la decepción del tratamiento y el retroceso de la enfermedad, se deben considerar más investigaciones utilitarias sobre los DTC.
El neuroblastoma es el tumor fuerte más reconocido y analizado en el primer año de vida. Se describe por una conducta clínica sorprendentemente diferente que va desde la recaída o el desarrollo sin restricciones hasta la enfermedad peligrosa. Esta variada variedad se debe fundamentalmente a la ciencia impredecible y las cualidades hereditarias del propio tumor. Mientras que los tumores con un resultado clínico positivo muestran con la mayor frecuencia posible variaciones cromosómicas numéricas y solo de vez en cuando las básicas, los neuroblastomas con un resultado clínico ominoso generalmente se caracterizan por anomalías cromosómicas segmentarias e intensificaciones de MYCN (MNA). Los estudios de secuenciación profunda han brindado más experiencia en la escena genómica del tumor, revelando que la cromotripsis, así como las transformaciones y borraduras de cualidades específicas se relacionan con enfermedades de alto riesgo en diferentes frecuencias5, 6. Además, se ha intentado mejorar nuestra comprensión del escenario transcriptómico de los neuroblastomas. En su mayor parte, estos exámenes investigaron la estimación pronóstica de los clasificadores basados en la expresión de calidad para el neuroblastoma, cerrando un pronóstico mejorado del punto final clínico.
Si bien todos estos estudios genómicos y transcriptómicos han impulsado nuestra comprensión de la enfermedad, se han centrado fundamentalmente en los tumores esenciales. Sea como fuere, un elemento típico en el neuroblastoma es la proximidad de células tumorales diseminadas (DTC) en la médula ósea (MO) de pacientes en estadio metastásico (M). Más del 90 % de los pacientes en estadio M presentan invasión de CDT en la MO en el momento del diagnóstico.10 La detección de CDT en la MO de pacientes que tienen más de un año y medio establecidos tiene una gran importancia pronóstica, ya que estos pacientes experimentan con la mayor frecuencia posible la los efectos nocivos de la repetición de la enfermedad y los malos resultados.11 Es importante destacar que la BM se puede utilizar para la evaluación subatómica de la enfermedad residual insignificante (MRD) y el pronóstico de resultados.
En nuestras investigaciones en curso, hemos demostrado que los DTC derivados de BM son razonables para los exámenes genómicos y transcriptómicos. Además, se ha demostrado que los DTC pueden ser profundamente instructivos con respecto a la prueba reconocible del clon de siembra de recaída. Sea como fuere, poco se piensa en los cambios de articulación de calidad que ocurren en los DTC tras la dispersión y el movimiento del tumor. Hasta este momento, solo una reunión solitaria ha realizado perfiles de articulación de calidad de DTC derivados de BM de 11 pacientes con neuroblastoma mediante investigación de microarrays. En este examen, Morandi et al. se centró principalmente en la identificación de cualidades comunicadas diferencialmente entre DTC demostrativos y tumores esenciales para distinguir cualidades que podrían servir como marcadores de pronóstico para pacientes con neuroblastoma de alto riesgo.
Materiales y métodos
Las pruebas esenciales de tumor y de MO se guardaron en nitrógeno líquido. Se prepararon portaobjetos de criosección de tumores y se realizaron tinciones con H&E. Los distritos ricos en células tumorales reconocidas se extrajeron de las piezas tumorales individuales y se homogeneizaron en QIAzol (Qiagen) con el GentleMACS Disociator (Miltenyi). La división MNC solidificada con dimetilsulfóxido (DMSO) de las succiones de BM se descongeló y se realizó una centrifugación por inclinación del espesor (LymphoprepTM, AXIS-SHIELD PoC AS). Después de la centrifugación en pendiente de espesor, los DTC se nombraron y avanzaron a 4 °C como se muestra anteriormente. En una palabra, la parte de MNC que contenía DTC se recogió después de la división por inclinación del espesor y se lavó con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 300 g durante 10 min a 4 °C. Se eliminó el sobrenadante y las célulasse resuspendieron en 2 ml de soporte de disposición de células activadas magnéticamente (MACS) enfriado con hielo (PBS pH 7,2, 0,5% de claras de huevo de suero de tipo buey, corrosivo tetraacético de etilendiamino 2 mM). A partir de ese momento, la suspensión celular se crió a 4 °C durante 20 min con 2,5 µl de anticuerpos anti GD2 marcados con FITC (clon 14.18 delta CH2), seguida de una eclosión de 15 min con 75 µl glóbulos atractivos anti???FITC (Miltenyi) a 4°C. La disposición de MACS se llevó a cabo a 4ºC y la parte de DTC potenciada y la parte de MNC empobrecida de células tumorales relacionadas se reunieron y homogeneizaron de forma independiente en QIAzol.
Todo el ARN se extrajo con el miRNeasy Micro Kit (Qiagen) siguiendo la convención del fabricante. La cantidad y la confiabilidad del ARN eliminado se evaluaron individualmente con el kit de ensayo Qubit RNA HS (Life Technologies) y el kit de ensayo Experion RNA StdSens (BioRad).
Se utilizaron 30 ng de ARN total para la amalgama de ADNc siguiendo la convención NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina (New England BioLabs) con el módulo de aislamiento magnético Poly(A) mRNA (New England BioLabs). Después de la mezcla de cDNA, la biblioteca se terminó en una ruta computarizada en EMBL Genomics Core Facility (Heidelberg, Alemania). RNA???Seq se realizó en la etapa Illumina HiSeq 2000. Se agruparon seis ejemplos por ruta y se crearon exámenes de extremo único de 50 pb.
El rendimiento normal de secuenciación de ARN crudo fue de 36 millones (M) de lecturas por prueba (ejecutar 12–172 M), de las cuales 16 M lecturas (44 %) se planificaron interesantemente para exones codificadores de proteínas (extender 5–74 M). Los exámenes se planificaron con GSNAP v2014???12–2818 ("– maxsearch = 100 – npaths = 1 – max???mismatches = 1 – novelsplicing = 0") a la referencia humana GRCh37 y luego se asignaron a los modelos de calidad Ensembl (fabricación 75 ) utilizando HTSeq19 ("htseq???count ???f bam ???t exon ???s no"). Las cualidades del ARNr se eliminaron del conjunto de calidad de Ensembl antes del conteo de lecturas y, de esta manera, se evitaron de todas las investigaciones subsiguientes. Polimorfismos de un solo nucleótido conocidos(SNP) y locales de injerto para GSNAP se separaron de la base de datos SNP (dbSNP) construcción 138 y Ensembl GRCh37 fabricación 75, individualmente. Después de la planificación y verificación de la lectura, se utilizó DESeq220 para llamar a las cualidades comunicadas diferencialmente (nbinomWaldTest, minReplicates = 5, cooksCutoff = 0,7, trim = 0,4). Lo que es más, utilizamos DESeq2 para producir una cuadrícula de articulación de calidad estandarizada (trabajo "fpm", robusto = TRUE) y varianza estabilizada (trabajo "vst") para importar y examinar más a fondo en Qlucore v3.2. Todos los ejemplos utilizados en este examen pasaron controles internos de control de calidad (QC), incluidas las características básicas, las tasas de planificación, las tasas de duplicación y la inclusión de 5′ a 3′, que se realizaron en función de los informes FastQC y RSeQC.
Resultados
Los DTC normalmente están subrepresentados en el BM, lo que requiere su mejora antes del examen de articulación de calidad. La penetración media de las células tumorales GD2POS en las succiones de MO (n = 42) se dictó por microscopía de inmunofluorescencia (IF) en un 20 % antes del realce (ejecutar 1 %–80 %) y 65 % (territorio 19 %–96 %) después mejora atractiva basada en perlas (Fig. (Fig. 22 a). El contenido de DTC después de la mejora dependía de la muestra con el 27 % de las pruebas que contenían <50 % de DTC, el 37 % de las pruebas que contenían la mitad del 75 % de DTC y 37 % de las pruebas con >75 % de DTC después de la mejora. En términos generales, el avance produjo un incremento triple en el contenido de células tumorales dentro de las pruebas de DTC. Las divisiones negativas (MNC) fueron analizadas por IF y todos los ejemplos con DTC de GD2POS notables fueron excluidos de una mayor investigación. .
Esperábamos que los contrastes en los ejemplos de articulación de calidad en todo el mundo estuvieran impulsados en gran medida por el tipo de célula (para acomodación, llamamos pruebas de tumor, DTC y MNC como tipos de células particulares en este artículo). Sin duda, el examen del segmento de la cabeza de todas las cualidades traducidas en tumores y MNCs aisló inequívocamente ejemplos por tipo de célula a lo largo del segmento principal de la cabeza (eje x???), con pruebas de tumores (16 ejemplos analíticos) agrupados a un lado y pruebas de MNC ( n = 28: 14 ejemplos indicativos y 14 pruebas de retroceso) a un lado. Entre estos dos grupos ya lo largo de un pivote similar, los DTC (n = 42: 22 analíticos y 20 de retroceso) se disiparon por su contenido de células tumorales. El estado de articulación de MYCN aclaró la gran mayoría del resto de la inconstancia de la articulación de calidad en las pruebas de tumor y DTC (segundo segmento de la cabeza, eje y???), descubriendo un impacto sólido de la regulación al alza de MYCN en la articulación de calidad mundial de tumores (n = 6 con MYCN???low y n = 10 con MYCN???high) y DTC (n = 26 con MYCN???low y n = 16 con MYCN???alto). Las pruebas de GSEA para DTC MYCN-high y MYCN-low descubrieron algunas cualidades asociadas a MYCN recientemente descritas, incluido un conjunto de calidad que contiene cualidades correguladas con la regulación positiva de MYCN en neuroblastomas esenciales. Además, la agrupación sin ayuda con las 100 mejores cualidades comunicadas diferencialmente entre las pruebas de DTC de MYCN de alto y de MYCN de bajo valor aisló tumores y DTC mediante la articulación de MYCN en oposición al tipo de célula o al contenido de células tumorales. Setenta y seis cualidades se regularon al alza en las pruebas altas de DTC MYCN, siendo MYCN en sí la calidad más fundamentalmente regulada (q = 3,7 × 10−51, log2FC = 4,9). Aparte de un caso (D04d, prueba con 82% de células tumorales), los niveles de articulación de MYCN estaban de acuerdo con el estado de MNA según lo dictado por la hibridación in situ con fluorescencia (FISH), así como el grupo de SNP (Tabla de información complementaria S1, con datos adicionales para D04d). D04d y la prueba de coordinación del tumor contenían aproximadamente 25 a 30 duplicados de MYCN según lo dictado por SNP. Lamentablemente, no se pudo acceder a datos de articulación sobre el tumor relacionado debido a datos corruptosARN en este ejemplo. Las 24 cualidades restantes se regularon a la baja en las pruebas altas de DTC MYCN. A pesar de que no se encuentra entre las 100 mejores cualidades dirigidas, MYC se reguló a la baja en las pruebas altas de DTC MYCN (q = 0,006, log2FC = 1).
Discusión
BM es un órgano de búsqueda incesante para DTC de diferentes tipos de crecimiento maligno. Puede completarse como una especialidad metastásica para los DTC, que finalmente pueden causar que la enfermedad se repita después del tratamiento. En este sentido, la proximidad de los CDT se considera un marcador de pronóstico importante para el resultado indefenso en diferentes tipos de crecimiento maligno, por ejemplo, crecimiento maligno del seno, sarcoma de Ewing y neuroblastoma, excepto para los tumores en estadio MS que, con la mayor frecuencia posible, muestran un crecimiento menor. La inclusión de BM a pesar de la mayor parte del buen resultado de la enfermedad. 3, 34 Por lo tanto, la representación de los TTD puede ayudar a mejorar nuestra percepción sobre la decepción del tratamiento y el retroceso de la infección.
Escaneamos los cambios de articulación que ocurren a lo largo de la dolencia al desglosar los perfiles de articulación de calidad de los DTC indicativos y de retroceso. De repente, la escena transcripcional de los TTD analíticos siguió en gran medida a la de los TTD de retroceso, a pesar de que estos pacientes habían recibido un tratamiento multimodal. Esta percepción podría ser aclarada por la especialidad de BM defensivo, de la misma manera que se ha indicado que el microambiente de BM mejora su resistencia, letargo, desarrollo y resistencia a la medicación. una mejora posicional en el cromosoma 19, con cinco cualidades silenciadoras de tumores que se regulan a la baja en los DTC de retroceso. A pesar de que las cancelaciones del cromosoma 19 rara vez se observan en el neuroblastoma, algunas investigaciones revelaron borrados o pérdida imparcial duplicada de heterocigosidad (cnLOH) en tumores esenciales con baja recurrencia. Curiosamente, nuestro continuoLa investigación descubrió una mayor recurrencia de cancelaciones fraccionarias del cromosoma 19 en los DTC de pacientes con reincidencia en comparación con los DTC indicativos. cualidades a ser codificadas por el p???brazo. Mientras que la regulación a la baja de las cualidades situadas en el q???arm puede aclararse, al menos a medias, mediante borrados de las cualidades específicas, las infrecuentes cancelaciones de calidad en el p???arm proponen otros componentes transregulatorios de articulación de calidad. De esta manera, las consideraciones epigenéticas que se concentran en los DTC parecen ser sensatas y podrían revelar más información sobre las modificaciones transcriptómicas que ocurren en estas células.
El cromosoma 19 codifica algunas cualidades silenciadoras de tumores muy retratadas cuya regulación a la baja está relacionada con el movimiento en otras enfermedades. Reconocemos que cinco de estas cualidades del silenciador de tumores están reguladas a la baja en los DTC de retroceso. BBC3/PUMA es un inductor básico de apoptosis cuya eliminación de la articulación es oncogénica y puede provocar una obstrucción útil. Un informe en curso mostró que BBC3/PUMA es el determinante básico de la reacción útil a la activación de p53 y la consiguiente apoptosis iniciada por Nutlin3a, una terapia contra el crecimiento maligno que se encuentra en ensayo clínico.40 Una evaluaciónconcentrado con flubendazol, otro exacerbado que aplica acción anticancerígena, reconoció al neuroblastoma como un elemento potencial de enfermedad sensible al flubendazol. La adecuación de flubendazol se amplió con nutlin®3, pero el efecto antineuroblastoma inducido por flubendazol se debilitó por completo tras el agotamiento de BBC3/PUMA en las líneas celulares de neuroblastoma examinadas. SIRT6 es otro silenciador de tumores que vimos regulado a la baja en los DTC de retroceso y cuya desgracia se relacionó con el resultado indefenso de algunas enfermedades. Examen de la información del genoma del cáncer La base de datos Atlas descubrió que SIRT6 se borró en el 20 % de los crecimientos malignos disecados. También se respondió que la desgracia y la regulación a la baja de las tres cualidades silenciadoras restantes en los DTC de las pruebas de retroceso, en particular STK11, CADM4 y GLTSCR2, estaban relacionadas con el movimiento tumoral en otras neoplasias malignas. De esta manera, aceptamos que la regulación a la baja de las cinco cualidades silenciadoras de tumores codificadas por el cromosoma 19 en los DTC de retroceso habla de una ventaja potencial de resistencia para los DTC.
Además, encontramos que las cualidades asociadas con el inicio de la metástasis y la angiogénesis estaban reguladas al alza en los tumores esenciales en lugar de los DTC y las MNC, que residen en la BM profundamente vascularizada. y los registros relacionados que están codificados por este pequeño genoma. Efectivamente, las multinacionales derivadas de BM también habían aumentado los niveles de registros de ADNmt en comparación con los tumores esenciales, aunque fundamentalmente no eran precisamente los DTC derivados de BM. Un incremento numérico en las mitocondrias es un rasgo característico de diferentes crecimientos malignos, y es notable que las mitocondrias confieren una adaptabilidad impresionante para las células enfermasen situaciones crueles, por ejemplo, hipóxico BM.45 Sin embargo, el alto nivel de registros codificados por mtDNA en DTC es algo sorprendente, ya que estas características codifican solo una minoría de subunidades que son fundamentales para las mitocondrias útiles. La mayoría de las subunidades, por ejemplo, para el complejo OXPHOS, está codificada por el nDNA. Sea como fuere, de la nada, estas cualidades no se regularon al alza en los DTC. Una posible aclaración de esta maravilla es la absorción de las mitocondrias utilitarias por parte de las células tumorales.del microambiente BM. En cualquier caso, los exámenes prácticos serán importantes para comprender el sistema específico y las razones del ADN mitocondrial elevado y los grados ampliados de registros codificados por él. Aparte de estos y otros contrastes, los DTC también tenían características oncogénicas del tumor. Especialmente, el registro de MYCN fue equivalente en las pruebas de tumores y DTC, al igual que el registro de MYC, que se demostró previamente que estaba anti-correlacionado con MYCN en el neuroblastoma.