Avances en Ingeniería Genética
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abstracto

Las dos formas de controlar la expresión de CjCas9 en la eliminación de la repetición patógena de GAA en el gen de la frataxina

Pouiré Yaméogo

 La mayoría de los casos de ataxia de Friedrich son causados por una inserción de una secuencia repetida de aGAA (GAAr) en el primer intrón del frataxingen que conduce a una disminución en la expresión de la proteína. La eliminación de este GAAr mediante la tecnología CRISPR-Cas9 conduce a un aumento de la expresión de infrataxina. Debido al tamaño limitado del paquete AAV, la eliminación de GAAr por parte de SpCas9 requirió dos virus asociados a Adeno (AAV). El uso de 2 AAV reduce la eficiencia de un tratamiento potencial ya que cada célula debe estar infectada por ambos virus. Por lo tanto, hemos usado CjCas9 porque es lo suficientemente pequeño como para ser administrado con dos sgRNA por un solo AAV. Sin embargo, una expresión constitutiva del gen CjCas9 administrado por un AAV in vivo puede aumentar las mutaciones fuera del objetivo e inducir una respuesta inmune contra la proteína Cas9. La expresión temporal es importante para el sistema CRISPR. Investigamos dos enfoques para limitar la expresión de la nucleasa. Primero, Hara Kiri molecular, transfectamos simultáneamente en plásmidos de células HeLa que codifican CjCas9, dos guías (pre y post GAAr) dirigidas al frataxingen y dos guías dirigidas al gen CjCas9. Nuestros resultados mostraron que a pesar de la autodestrucción del gen CjCas9, se obtuvo in vitro una edición genómica efectiva del gen FXN. En segundo lugar, CRISPR-SCReT (Stop Codon Read Through), insertamos un codón de terminación (TGA) al comienzo del gen CjCas9 para reprimir su expresión. Posteriormente, indujimos la expresión de Cas9 por moléculas capaces de permitir la traducción a pesar de la presencia del codón de parada prematuro. Este plásmido se transfectó en células 293T con dos sgRNA (pre y postGAAr). Observamos la eliminación de GAAr solo en células tratadas con G418. Estos diferentes métodos permitieron obtener una edición eficiente del gen de la frataxina mientras evitaban una expresión sostenida de Cas9. Esto podría reducir las posibilidades de mutaciones fuera del objetivo y reacciones inmunitarias contra la proteína Cas9.