Revista internacional de minería de datos biomédicos
Acceso abierto
ISSN: 2090-4924
ISSN: 2090-4924
Chan-Shing Lin
Abstracto
Los betanodavirus causan una corrupción ansiosa mortal en más de cuarenta tipos de peces. Presentaré las guías de microscopía crioelectrónica (cryo-EM), desde 2001 cuando se distribuyó la guía principal, en contraste con las difracciones de rayos x. Durante el período de objetivo bajo de mapas de 10-20 Å, los aspectos más destacados subatómicos del virus de la necrosis nerviosa del mero dragón(DGNNV) fueron seriamente contemplados. Las partículas similares a infecciones (VLP) están formadas por la proteína de la cápside única que se transmitió en E. coli, levadura o célula de bicho raro, mientras que las VLP no se descubrieron cuando 35 aminoácidos en el extremo N o cuatro aminoácidos en C- final fueron borrados. Los depósitos de ácidos aspárticos que cooperan con los cationes se consideran críticos para la seguridad de las VLP, mientras que los límites potenciales de disulfuro de las acumulaciones de cisteína no eran básicos para la unión de moléculas. En la vía del paso de DGNNV a las células de los peces, se propuso la conexión de la micropinocitosis con la proteína de aturdimiento por calor similar a HSP90, mientras que la colaboración detallada del área de distensión con la proteína unida a los lípidos se explora utilizando la refractividad del haz de x. Tres áreas de la proteína de la cápside (unión de ARN, cubierta, y espacios de proyección) en clones acortados se resolvieron a 4-6 Å utilizando difracción de haz x. La estructura propuesta del Betanodvirus desde 2001 se confirmó doblemente, a pesar de que se encontró otro sitio de restricción de cationes en la proyección. Recientemente, cryoEM con una cámara de ubicación inmediata para superar los problemas de daño por radiación y movimiento de ejemplo brinda estructuras nucleares cercanas a las T = 3 DGNNV VLP. La estructura del espacio de la capa (52-213aa) en condiciones fundamentales frágiles se resolvió en un objetivo de 3,56 Å y un modelo nuclear que se ensambló de nuevo revela conexiones proteína-proteína, extensiones de partículas de calcio y colaboraciones especiales de cationes. Las asociaciones de cationes asientan la molécula manteniendo tres subunidades en una unidad desequilibrada de trímero y fijando unidades incorrectas en un icosaedro y sus modificaciones han provocado el desarrollo o la alteración de la molécula. La estructura crio-EM cambia al sumergirse en una condición ácida que copia la ruta de paso de la endocitosis y recomienda un componente de detección de pH para que el aparato NNV de la piscine transmita su genoma.
Introducción
En la familia Nodaviridae, una matriz de 180 CP estructura una cápside de T = 3 de distancia a lo largo de ~ 29-35 nm. CP normalmente se hace a partir de la geografía de movimiento de atasco central, dando forma a un sándwich β ojo a ojo con dos juegos de hojas β contra iguales. Durante la reunión de la molécula de alfanodavirus, la escisión autocatalizada de la proteína α anterior produce las proteínas β y γ, que son necesarias para el desarrollo auxiliar de la cápside. La proteína β estructura el ocho enemigos autorizados de cadenas β iguales con extremos N y C situados dentro de la molécula de infección. Se requiere el extremo N excepcionalmente fundamental de la proteína β para matar el ARN encapsidado.dúplex; también actúa como un cambio subatómico para controlar el tamaño heterogéneo y el estado de las partículas. Las complementariedades básicas entre las diversas cepas de la familia alphanodavirus parecen salvadas, a pesar de la presencia de enormes separaciones evolutivas en las relaciones filogenéticas. En cualquier caso, no existe una gran homología en los arreglos de CP entre alfanodavirus y betanodavirus. Genotipos del betanodavirus de la cepa RGNNV separados de varias especies de mero, por ejemplo, infección por putrefacción aprensiva del mero de manchas naranjas (OSGNNV), corrupción ansiosa del mero dragón(DGNNV) y la infección por pudrición ansiosa del mero Malabaricus (MGNNV), contienen genomas profundamente moderados. Tres espacios significativos continuos de MGNNV CP, incluido el distrito N-terminal, el área de superficie del sándwich β y el espacio de distensión trimérica, se han concentrado recientemente mediante imágenes de microscopía electrónica criogénica (crio-EM) en el objetivo de 23 Å y 3D-PSSM pronóstico. Sea como fuere, actualmente no hay datos básicos de alto nivel sobre la asociación relacionada con la cápside del tipo betanodavirus.
En este informe, retratamos la estructura de la gema de la infección por putrefacción ansiosa del mero (GNNV) de la familia betanodavirus en diferentes estructuras: (I) una molécula similar a GNNV T total = 3 (GNNV-LP) con un objetivo de 3,6 Å; (ii) T = 1 partículas subvirales (SVP) del monstruo del área delta-P a 3,1 Å; (iii) el fenómeno de cancelación N-ARM a 7,0 Å; y (iv) el espacio P individual de GNNV CP a 1,2 Å. La estructura gema de GNNV-LP muestra algunas variedades críticas y específicas en la ingeniería de la cápside y los componentes subatómicos de la cápside se combinan en contraste con la variedad alfanodavirus y otros ARN .infecciones Específicamente, hemos reconocido las cualidades básicas racionalizadas del espacio shell en GNNV. Los diferentes tipos de cápsides T = 3 y T = 1 GNNV muestran que el tema rico en arginina N-terminal (N-ARM) actúa como un interruptor subatómico. En segundo lugar, el área P, con su tema DxD junto con dos partículas de Ca2+ unidas, asume un papel importante en la trimerización del GNNV CP y la reunión de moléculas. Estas sutilezas básicas de alto nivel contribuyen aún más a nuestra comprensión de arriba a abajo de los componentes atómicos de la acumulación y contaminación viral, y deberían proporcionar la premisa auxiliar para contemplar el avance de la familia Nodaviridae.
Métodos
Cada intento de criatura se actuó de acuerdo con las sugerencias de la guía para el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Nacional Cheng Kung. La convención fue ratificada por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Nacional Cheng Kung (IACUC #100065).
Creación y descontaminación de moléculas de GNNV y CP de GNNV abreviadas
Una disposición de ADN CP de acuerdo de la infección por putrefacción ansiosa del mero con manchas naranjas (OSGNNV) RNA2 (promoción de GenBank n.º KT071606) se mejoró mediante PCR y se clonó en un vector pET32-Xa/LIC ajustado que transportaba depósitos de histidina 6x y SUMO de levadura (SMT3) como la etiqueta de combinación N-terminal [54]. Este desarrollo se comunicó en E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL (Stratagene), y las células se refinaron en stock de Luria Bertani (LB) (Merck) que contenía cloranfenicol (34 μg/ml) y ampicilina (100 μg/ml). ) hasta que la DO llegó a 0,6–0,7 a 600 nm a 37 °C. Se añadió IPTG (isopropil \beta - D - tiogalactopiranósido) (Bioshop) a un último grupo de 0,5 mM y las sociedades se incubaron por el momento a 18ºC. las celulasse recogieron y se agitaron mediante sonicación en cuna de lisis (Tris HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 0,25 M, imidazol 20 mM, β-mercaptoetanol 5 mM y EGTA 1 mM). CP se descontaminó a través de una sección de Ni-NTA (GE Healthcare). La etiqueta SUMO se dividió utilizando la proteasa SUMO que luego se expulsó con un segmento Ni-NTA.
El GNNV CP limpio se debilitó a una agrupación de 0,3 mg/ml y se dializó por el momento a 4°C contra cojín de lisis sin EGTA o β-mercaptoetanol en una proporción de 1:150. Se añadió (NH4)2SO4 (750 mM) a la diálisis y, por fin, se dializó GNNV CP contra el cojín de la disposición GNNV-LP (20 mM Tris HCl (pH 8,0), 0,2 M NaCl, 1 % (v/v) glicerol y CaCl2 2 mM). El tamaño de GNNV-LP se estimó mediante cromatografía de evitación de tamaño en una sección Superose 6 10/300 GL (GE Healthcare). El GNNV-LP limpio se concentró a 30 mg/ml y se guardó a 4°C.
Resultados
T = 3 estructura icosaédrica de GNNV-LP
Las CP de SUMO-GNNV se sobreexpresan en Escherichia coli (E. coli) y las GNNV-LP se autorecolectan in vitro. A la vista de las imágenes EM, la morfología de GNNV-LP muestra una cápside T = 3 con una medida de 30~35 nm. Decidimos la estructura de la gema de T = 3 GNNV-LP utilizando la técnica de inicio del músculo del estómago con un promedio de equilibrio no cristalográfico (NCS) y refinamos la estructura a 3,6 Å. El espesor de electrones de la unidad asimétrica icosaédrica (iASU) de T = 3 GNNV-LP permite mostrar los depósitos 52-338 para las subunidades An y B, y las acumulaciones 34-338 para la subunidad C. El resto de la sección N-terminal de cada subunidad, que contiene N-ARM, el tema rico en arginina decididamente cargado 23RRRANNRRRSN33, está confundida.
La estructura topológica general del GNNV CP se compone del brazo N-terminal (N-arm) (depósitos 34-51), el espacio envolvente (S-area) (construcciones 52-213), el distrito de enlace (depósitos 214-220 ) y el espacio abombado (área P) (depósitos 221−338). El brazo N dispuesto existe a lo largo de la interfaz icosaédrica de dos superposiciones (I2) de la superficie interna, y extiende su extremo N hasta el pivote icosaédrico de tres superposiciones (I3) para enmarcar un anillo β. El espacio S involucra un enemigo de ocho abandonados de igual sándwich β con tres hélices α cortas, que es un elemento auxiliar aceptado como diferentes CP de infección. Las áreas S y P individuales del GNNV CP, asociadas por el distrito de enlace adaptable, no colaboran entre sí legítimamente. El espacio P se pliega en una estructura autónoma,
Sesenta espacios S triméricos participan entre los contactos de las subunidades, dando forma a una capa delgada persistente de la cápside con un orificio interno vacío. Tres espacios P vecinos por iASU se agarran entre sí en los hachas de guerra semi-tres superpuestos (Q3) para dar forma a 60 proyecciones en la superficie de la molécula. Tres áreas S monoméricas vecinas de las subunidades A, B y C están ocupadas con comunicaciones diméricas, triméricas y pentaméricas a lo largo de los tomahawks I2, I3 e icosaédricos de cinco superposiciones (I5). A pesar de que la CP de GNNV (338 depósitos) es más corta que la CP de alfanodavirus (407 acumulaciones), la asociación básica de la cápside de GNNV con sus 60 proyecciones enormes revela un diseño T = 3 con un tamaño de molécula como el alfanodavirus reducido. estructura, en la que los extremos N y C de la CP están situados dentro de la cápside.
Discusión
En la familia Nodaviridae, el ARN2 codifica la CP requerida para la recolección de moléculas y asociada con la particularidad. El árbol filogenético de conjuntos de agrupaciones aminocorrosivas coordinadas de CP delegadas de la familia Nodaviridae demuestra que el alfanodavirus y el betanodavirus comenzaron en varias herencias y se aislaron en un signo particular notable de parentesco.
Reconocimiento
Estamos agradecidos con el personal de las líneas de luz BL13B1, BL13C1 y BL15A1 en el Centro Nacional de Investigación de Radiación Sincrotrón (NSRRC) en Taiwán y el personal de la línea de luz contratada de Taiwán BL12B2 y Eiki Yamashita en el BL44XU en SPring-8 en Japón por su ayuda especializada bajo los números de proposición 2012A4009, 2012A6760, 2012A6600, 2012B4002, 2012B4012, 2012B6600, 2013A4011, 2013A6600, 2013B4000, 2013B6600, 2014A400 0, 2014A6600, 2014A6965 y 2014A4004. Damos las gracias a Ting-Fang Wang por el vector de articulación SUMO. Expresamos nuestro agradecimiento a Christina Ling Chang, Yee-Shin Lin y KC Han-Ching Wang por la significativa conversación. Partes de este examen se completaron en el Laboratorio de Cristalografía de Proteínas NSRRC-NCKU del Centro Universitario de Biociencia y Biotecnología de la Universidad Nacional Cheng Kung (NCKU).