Revista de Proteómica y Bioinformática
Acceso abierto

abstracto

Fraccionamiento de péptidos basado en SCX dirigido para una secuenciación óptima inducida por colisión y disociación por transferencia de electrones

Henk W. P. van den Toorn, Shabaz Mohammed, Joost W. Gouw, Bas van Breukelen y Albert J.R. Heck

La disociación por transferencia de electrones (ETD) de iones peptídicos se ha introducido como una herramienta para la secuenciación de péptidos basada en espectrometría de masas, complementaria a la colisión de uso común disociación inducida (CID). Se ha propuesto que ETD puede tener un mejor rendimiento que CID para péptidos más cargados y/o más grandes. Aquí, comparamos el rendimiento de ETD y CID en los datos generados en un experimento de proteómica a gran escala. En primer lugar, los péptidos proteolíticos trípticos de los ovocitos de Drosophila melanogaster se separaron fuera de línea en función de su estado de carga neta en solución mediante cromatografía de intercambio catiónico fuerte (SCX), seguida de una separación por cromatografía líquida en línea de fase inversa (RP) acoplada a un espectrómetro de masas con trampa de iones. con capacidades ETD. Los picos de MS seleccionados por el espectrómetro de masas se sometieron a ETD y CID, lo que permitió una comparación justa. Alrededor de 2300 péptidos fueron identificados exclusivamente por CID y, de manera similar, más de 3000 por ETD con aproximadamente 1400 por ETD y CID. En total, se identificaron casi 7000 péptidos con una puntuación de corte de péptido Mascot muy conservadora de 60, lo que verifica claramente que ETD y CID son técnicas complementarias. En las primeras fracciones SCX, que contienen péptidos con un ‘bajo’ carga neta, más del 90 % de los péptidos se pudieron identificar con éxito mediante CID, mientras que en las fracciones SCX posteriores más del 90 % de los péptidos identificados se pudieron identificar con éxito utilizando solo ETD. La estrategia elegida, con una combinación de SCX y RP-LC-MS/MS, permite al usuario tomar decisiones específicas sobre si usar CID y/o ETD de manera óptima. El análisis de la secuencia y el contenido de aminoácidos de todos los péptidos identificados reveló claramente que el rendimiento impresionante de ETD para péptidos que poseen estados de carga superiores a tres no requiere una secuenciación basada en CID que, en el mejor de los casos, sería únicamente de confirmación.