Técnicas Avanzadas en Biología y Medicina
Acceso abierto

abstracto

Estrategia para la determinación del estado de fosforilación del receptor β1-adrenérgico in vivo

Kozo Hayashi y Hiroyuki Kobayashi

El receptor β1-adrenérgico (Adrb1), un miembro de la superfamilia de receptores acoplados a proteína G (GPCR), es un regulador crítico de la función cardíaca . Todos los GPCR se fosforilan en múltiples sitios y el patrón específico de fosforilación actúa como un "código de barras". para regular la función del receptor y los procesos fisiológicos aguas abajo de una manera específica de tejido. Sin embargo, se sabe poco sobre la ubicación y función de los sitios de fosforilación de Adrb1 in vivo debido a la falta de anticuerpos específicos. Como primer paso para identificar los estados de fosforilación de Adrb1 y las funciones asociadas en el corazón de ratón in vivo, desarrollamos la siguiente estrategia experimental: 1) identificación de sitios de fosforilación de Adrb1 dependientes de agonistas en corazón de ratón perfundido aislado utilizando técnicas avanzadas de fosfoproteómica; 2) asignación definitiva de estos sitios de fosforilación mediante datos de espectrometría de masas (EM) de alta calidad obtenidos de células HEK 293T que sobreexpresan Adrb1; 3) generación de ratones knock-in (KI) que expresan Adrb1 fusionados con etiqueta FLAG en el extremo N para la purificación por inmunoafinidad para revelar el estado de fosforilación dentro del organismo vivo; 4) elucidación de los niveles de fosforilación en sitios específicos de Adrb1 en el corazón de ratón KI mediante medidas de MS de péptido fosforilado a relaciones de intensidad de iones de péptido no fosforilado correspondientes. Usando esta estrategia, identificamos Ser462 en el extremo C-terminal de Adrb1 como un sitio de fosforilación dependiente de agonista en el corazón de ratón perfundido. También revelamos las proporciones de fosforilación basal en Ser274 (0,25), Ser417 (0,55) y Ser462 (0,0023) en ratones KI. Estos hallazgos brindan nuevos conocimientos sobre los mecanismos reguladores de la función Adrb1 mediada por la fosforilación específica del sitio.