Diario de Ensayos Clínicos
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abstracto

Detección sensible del receptor del factor de crecimiento epidérmico T790M usando BNAClamp Real-Time PCR

Austin Dinkel, Rachel A. Hoffmeister, Andrew Huckelby, Aaron S. Castro, Miguel M. Castro, SungKun Kim*

Las mutaciones en el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) causan una variedad de cánceres, incluidos los de mama y pulmón. La única mutación T790M en el dominio de tirosina quinasa de EGFR significa la respuesta a los medicamentos contra el cáncer gefitinib, lo que conduce al desarrollo de resistencia a dicho medicamento. De este modo, la detección de la mutación proporciona opciones terapéuticas eficaces para los pacientes que necesitan tratamientos farmacológicos contra el cáncer. Buscamos desarrollar un método de detección fácil y rápido para la mutación T790M utilizando ácidos nucleicos en puente (BNA), que se sabe que mejora la afinidad de hibridación de los oligonucleótidos. Se utilizaron oligonucleótidos que contienen bases BNA, llamados BNA-clamp y diseñados para bloquear la reacción de PCR contra genes de tipo salvaje, para discriminar la presencia de genes mutantes mezclados con una gran cantidad de genes de tipo salvaje. La PCR en tiempo real en conjugación con BNA-clamping nos permite observar diferentes grados de amplificación de PCR dependiendo de la proporción de genes de tipo salvaje y mutantes. En un esfuerzo por explorar la posibilidad, se prepararon varias abrazaderas de oligonucleótidos de 13 unidades con varios números de bases de BNA. El análisis del valor de Tm sugiere que las abrazaderas que contienen 9 bases BNA (BNA-clamp-9) serían más efectivas para distinguir el mutante de los genes de tipo salvaje, y las pruebas de sensibilidad que usan BNA-clamp-9 revelaron que la abrazadera tenía la capacidad de detectar 0,1 % o niveles más bajos de la mutación T790M entre los genes de tipo salvaje. Además, las estructuras de unión se analizaron mediante simulaciones de dinámica molecular (MD), lo que reveló que BNA-clamp-9 distorsiona la estructura BDNA construida originalmente. Además, a través del muestreo paraguas, se obtuvieron energías libres de unión con -60 kJ/mol para el gen de tipo salvaje y -40 kJ/mol para el gen mutante. Esta tecnología de PCR en tiempo real y bloqueo de BNA puede ofrecer una vía prometedora para detectar mutaciones clínicamente importantes en el futuro