Revista de Oftalmología Clínica y Experimental
Acceso abierto

abstracto

Búsqueda de variantes empalmadas alternativas del dominio de fosfolipasa que contiene 2 (Pnpla2), un gen novedoso en la retina

Jacqueline Talea DesJardin, S Patricia Becerra y Preeti Subramanian

Propósito: Ensembl y otras bases de datos de etiquetas de secuencia expresada (EST) revelan empalmes alternativos putativos variantes en ratones y ratas para Pnpla2, el gen que codifica el receptor del factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF-R). El propósito de este estudio fue obtener evidencia experimental para las variantes de empalme de Pnpla2 en ratones.

Materiales y métodos: Se utilizaron cultivos de una línea celular de ratón derivada de fotorreceptores (células 661W) y tejidos de ojo, corazón, tejido adiposo, riñón e hígado de ratón. Se aisló ARN mensajero (ARNm) de células y tejidos, y se sintetizó ADN complementario (ADNc). Se diseñaron pares de cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para flanquear los sitios de empalme putativos. Se utilizó PCR en tiempo real con exclusión de exón para reducir la amplificación del transcrito Pnpla2 de longitud completa y mejorar la amplificación de variantes de corte y empalme poco abundantes. Los productos de PCR se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa y se detectaron con un transiluminador UV. Los plásmidos recombinantes que contenían un ADNc de PNPLA2 de longitud completa humana o un ADNc de PNPLA2 que carecía del exón 5b (E5b) fueron controles para validar las técnicas. Se prepararon lisados celulares totales de células 661W. La detección de la proteína PEDF-R se realizó mediante transferencias Western.

Resultados: los productos de PCR para los transcritos de Pnpla2 obtenidos de células 661W o varios tejidos de ratón se resolvieron en una sola banda después de la amplificación con varios pares de cebadores. La amplificación simultánea de dos ADNc de PNPLA2 en varias proporciones molares impidió la detección de transcritos más abundantes. Sin embargo, incluso cuando el cDNA para la transcripción completa de Pnpla2 se excluyó significativamente mediante el método de exclusión de exón, no se detectaron bandas correspondientes a las variantes de empalme de Pnpla2. No obstante, las transferencias de Western de lisados celulares de 661 W totales con dos anticuerpos diferentes revelaron isoformas para la proteína PEDF-R.

Conclusiones: Los datos proporcionan evidencia de la existencia de una sola transcripción Pnpla2 de longitud completa que podría dar lugar a un único producto proteico que se somete a un procesamiento postraduccional.< /p>