Revista de glucómica y lipidómica
Acceso abierto
ISSN: 2153-0637
ISSN: 2153-0637
joon kim
La proteína ribosómica S3 (rpS3) es un componente de la subunidad pequeña ribosómica 40S, pero tiene muchas otras funciones extrarribosómicas como la apoptosis, el control del ciclo celular , la reparación del ADN, etc. Tiene una actividad de endonucleasa de reparación del ADN que está relacionada con varios tipos de cáncer. Recientemente, hemos descubierto que esta proteína es secretada solo por varias líneas de células cancerosas como un homodímero, pero no en células normales. También confirmamos que rpS3 se secreta más en los medios de las líneas celulares de cáncer más invasivas . Actualmente, confirmamos que la proteína secretada está glicosilada en el residuo de Asn 165 y la mutación puntualen este sitio es defectuoso para la secreción. La vía de secreción resultó ser una vía dependiente de ER-Golgi. Proponemos que la rpS3 glicosilada podría usarse como un marcador de cáncer útil. rpS3 mostró un ligero desplazamiento hacia abajo cuando la proteína digesRibosomal S3 (rpS3/RPS3/Ribosomal Protein S3) es un constituyente de la subunidad pequeña ribosomal 40 S, que funciona en la traducción. Las funciones extraribosómicas incluyen la reparación del ADN, la apoptosis y la regulación transcripcional. RpS3 interactúa con nm23-H1, que actúa como un supresor de metástasis en ciertos tumores humanos y evita el potencial invasivo en las células HT1080. Además, rpS3 se sobreexpresa en el cáncer colorrectal.células, lo que sugiere que el nivel de rpS3 puede estar relacionado con la tumorigénesis. Un estudio anterior mostró que la rpS3 se secretaba en el entorno extracelular en forma dimérica. El nivel de secreción de rpS3 aumentó notablemente en las células altamente malignas en comparación con las células originales normales . Esto sugiere que la rpS3 secretada puede ser un marcador putativo de tumores malignos. Alrededor del 10% de todas las proteínas humanas son proteínas secretoras. Estos incluyen citocinas, hormonas, enzimas digestivas e inmunoglobulinas. Sus diversas funciones incluyen defensa inmune, comunicación intercelular, morfogénesis, angiogénesis, apoptosis.y diferenciación celular. La mayoría de las proteínas secretoras con extremos amino o secuencias de señales internas están dirigidas a la superficie celular o al espacio extracelular. La secuencia de señal se reconoce a través de una proteína de reconocimiento de señal (SRP) y se escinde una vez que la proteína ha cruzado al retículo endoplásmico (RE). Las proteínas recién sintetizadas salen de la sala de emergencias y están recubiertas por un complejo de proteína de cubierta II que contiene carga (COPII/SEC23A), y las dirige para su transporte al aparato de Golgi, donde se modifican, procesan, clasifican y envían hacia su destino final. Después de pasar por el aparato de Golgi, las proteínas secretoras se clasifican y empaquetan en intermediarios de transporte post-Golgi, que se mueven hacia la membrana plasmática y se fusionan con la superficie celular. Las modificaciones postraduccionales son comunes en las proteínas secretadas por eucariotas. La glicosilación de proteínas, una de las modificaciones postraduccionales más abundantes en todos los organismos, se refiere a la unión de fracciones de sacárido a proteínas. La glicosilación participa en el plegamiento, la interacción, la estabilidad, la movilidad, la adhesión celular y la transducción de señales de las proteínas. Los glicanos de las proteínas secretadas son importantes para la secreción de proteínas, ya que influyen en el plegamiento de proteínas, proporcionan ligandos para chaperonas de lectina, contribuyen a la vigilancia del control de calidad en el ER y median el tránsito y la orientación selectiva de proteínas a lo largo de la vía secretora. Los dos tipos principales de glicosilación son la glicosilación ligada a N y la ligada a O. Los glicanos se unen a estructuras polipeptídicas a través de enlaces amida a cadenas laterales de asparagina (Asn), mientras que los enlaces glucosídicos ocurren con las cadenas laterales de serina/treonina (Ser/Thr), hidroxilisina o tirosina (Tyr), y esta última implica O-glicosilación. Aproximadamente la mitad de todas las proteínas humanas son glicoproteínas, y la mayoría contiene estructuras de N-glucanos. Los N-glucanos se sintetizan inicialmente como precursores de oligosacáridos ligados a lípidos y se transfieren desde los oligosacáridos ligados a lípidos a residuos de Asn seleccionados de los polipéptidos que han entrado en la luz del RE. Los organismos eucariotas generalmente usan una oligosacariltransferasa de múltiples subunidades en la cara lumenal de la membrana del RE para catalizar la transferencia de glicano a las secuencias de péptidos aceptores, que están compuestos por un tripéptido Asn-X-(Ser/Thr) (y con menos frecuencia de AsnX-cisteína (Cys ) y otras secuencias no estándar), donde X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. La oligosacariltransferasa facilita el enlace N-glucosídico entre la amida de cadena lateral de Asn y el oligosacárido. Casi todos los glicanos de las glucoproteínas están sujetos a recorte y extensión a medida que atraviesan el aparato de Golgi. El presente estudio demuestra que rpS3 se secreta en el medio de cultivo celular a través de la vía dependiente de ER-Golgi. La secreción, detectada mediante un ensayo ELISA, puede utilizarse como indicador demalignidad de células cancerosas in vitro. También se demuestra que la glicosilación ligada a N es importante para la secreción de rpS3 y que Asn165 es el sitio de N-glucosilación, según lo confirmado por cromatografía líquida, espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) y mutagénesis dirigida al sitio. Finalmente, rpS3 forma un homodímero a través de interacciones de las regiones media y N-terminal. RESULTADOS La secreción de rpS3 es inhibida por la brefeldina a, la tunicamicina y la monensina. La rpS3 parece estar localizada tanto en el citoplasma como en el núcleo. Anteriormente se informó que la rpS3 se secreta en el entorno extracelular como un homodímero. Aunque el mecanismo de secreción no se conoce bien, la secreción de rpS3 parece estar relacionada con la malignidad invasiva del cáncer.células. Para confirmar si la secreción de rpS3 estaba regulada por la ruta de ER a Golgi o de Golgi a ER, las células HT1080 se trataron con Brefeldina A como inhibidor del transporte de ER-Golgi o Monensina como inhibidor del transporte de Golgi-ER. Con una confluencia del 70 ~ 80 %, las células HT1080 se incubaron en medio DMEM sin suero en ausencia o presencia de Brefeldin A o Tu. Cada medio de cultivo fue recolectado y precipitado para inmunoblot, ELISA e inmunohistoquímicaensayo Brefeldin A y Monensin redujeron la secreción de rpS3. Para confirmar aún más la localización de la proteína rpS3 en ER o Golgi, se realizó un análisis inmunofluorescente confocal utilizando el anticuerpo rpS3 y el colorante ER-Tracker™ Red para ER o el colorante BODIPY TR para Golgi. La localización de rpS3 en ER y Golgi aumentó claramente en las células tratadas con Brefeldina A y Monensina en comparación con las células no tratadas. El análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) usando proteína fluorescente verde (GFP) etiquetada con rpS3/GFPexpresó la localización de la línea celular estable de rpS3 en ER o Golgi se incrementó más de 10 veces a través del tratamiento con Brefeldina A o Monensina. Estos resultados sugieren que la rpS3 es secretada por las células HT1080a través de las vías ER-Golgi y Golgi-ER. Para cuantificar el ensayo ELISA de la rpS3 secretada, realizamos un ensayo ELISA con proteína rpS3 recombinante. Para determinar si la glicosilación es necesaria para la secreción de células rpS3, HT1080se trataron con tunicamicina para inhibir la unión de la cadena precursora de glicano ligada a N al péptido naciente, y se realizaron un ensayo de inmunotransferencia y ELISA. El nivel de secreción de rpS3 disminuyó en presencia de tunicamicina, lo que indica que se requiere la N-glicosilación para la secreción de rpS3. Se probaron tubulina y C23 con los anticuerpos relevantes para excluir la posibilidad de que la rpS3 detectada en los medios de cultivo pudiera derivar de necrosis o ruptura. C23 (NCL/Nucleolin), un marcador nuclear, no se detectó en los medios de cultivo celular. Como el MIF se secreta a través de una vía secretora no convencional y no está glicosilado, se empleó como control negativo. La secreción de MIF no fue inhibida por Brefeldin A o Tunicamicina, y la apoptosis celularno fue inducida en presencia de Brefeldin A o Tunicamicina. Estos resultados sugieren que la rpS3 secretada está N-glicosilada a través de la ruta típica de ER-Golgi. La rpS3 secretada está N-glicosilada Para confirmar la glicosilación ligada a N de la rpS3 secretada, los medios de cultivo celular concentrados se inmunoprecipitaron usando un anticuerpo anti-rpS3 y se trataron con o sin PNGasa F, que puede eliminar los glicanos ligados a N. La banda equivalente a la rpS3 secretada mostró un ligero desplazamiento hacia abajo cuando se digirió con PNGasa F, lo que indica que la rpS3 secretada estaba N-glicosilada. El análisis de unión de lectina se realizó adicionalmente para confirmar la glicosilación ligada a N de la rpS3 secretada. Con A es una lectina que reconoce residuos de manosa y glucosa terminales ligados a alfa, confiriendo la capacidad de aislar proteínas N-glicosiladas en lisados celulares y medios de cultivo concentrados. Como se muestra en, Con A se unió a rpS3 tanto en los lisados celulares como en los medios, lo que indica la presencia de glucanos unidos a N. La lectina Con A no detectó otra proteína ribosómica, el receptor de la proteína quinasa C1 activada (RACK1), lo que sugiere que los ribosomas no interactúan con Con A y que RACK1 no está N-glicosilado. Se utilizó MIF como marcador de proteína no glicosilada, mientras que el miembro 6 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (FAS) se empleó como marcador de proteína N-glucosilada. Los resultados confirmaron que la rpS3 secretada está N-glicosilada. Identificación de sitios de glicosilación ligados a N en rpS3 por El receptor de la proteína quinasa C1 activada (RACK1) no fue detectado por la lectina Con A, lo que sugiere que los ribosomas no interactúan con Con A y que RACK1 no está N-glicosilado. Se utilizó MIF como marcador de proteína no glicosilada, mientras que el miembro 6 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (FAS) se empleó como marcador de proteína N-glucosilada. Los resultados confirmaron que la rpS3 secretada está N-glicosilada. Identificación de sitios de glicosilación ligados a N en rpS3 por El receptor de la proteína quinasa C1 activada (RACK1) no fue detectado por la lectina Con A, lo que sugiere que los ribosomas no interactúan con Con A y que RACK1 no está N-glicosilado. Se utilizó MIF como marcador de proteína no glicosilada, mientras que el miembro 6 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (FAS) se empleó como marcador de proteína N-glucosilada. Los resultados confirmaron que la rpS3 secretada está N-glicosilada. Identificación de sitios de glicosilación ligados a N en rpS3 poranálisis de espectrometría de masas Para identificar los sitios de glicosilación ligada a N en rpS3, se preparó una gran cantidad de proteína rpS3 secretada. El medio de cultivo de células HT1080 enriquecido se sometió a inmunoprecipitación usando el anticuerpo rpS3. La rpS3 aislada se separó mediante SDS-PAGE grande y luego se tiñó con azul brillante de Coomassie. Se llevó a cabo MS para identificar qué residuos de Asn eran los sitios de glicosilación. La banda de rpS3 purificada se sometió a digestión con PNGasa F. Dado que la PNGasa F es una amidasa, los residuos de Asn de los que se eliminaron los glucanos se desaminaron a residuos de Asp, lo que dio como resultado un aumento en la masa peptídica de una unidad. Después de la digestión con tripsina, los péptidos trípticos desglicosiladosfueron identificados selectivamente por LC-MS/MS. El aumento de 1 Da en la masa peptídica para cada conversión de Asn a Asp se usó como firma de diagnóstico para identificar los péptidos glicosilados. Se buscó en los espectros de masas la desaminación de los residuos de Asn usando el software Mascot. La puntuación de iones fue –10* Log (P), donde P es la probabilidad de que la coincidencia observada sea un evento aleatorio. Las puntuaciones de iones individuales superiores a 4 indican identidad u homología extensa (P < 0,05) en el mapa de cobertura de secuencia de la proteína identificada. Los iones peptídicos observados representaron una cobertura de secuencia del 46 %. Se detectaron dos (Asn22 y Asn165) de los tres residuos de Asn en rpS3, mientras que la EM no detectó el péptido Asn57. Por lo tanto, construimos N57G y NNGG como una doble mutación.tanto de Asn57 como de Asn165. Los valores del peso molecular del péptido, que se puede ionizar de varias formas, se indican en la Tabla complementaria S2. El peso molecular observado por LC-MS/MS se representa en rojo. Se detectó Asn22 nativo, mostrando los valores para el peso molecular del péptido Phe11-Arg40. El peso molecular después de la eliminación de los oligosacáridos con PNGase F se muestra en la Tabla complementaria S2B. Mientras que la masa molecular de Asn22 se detectó como 779,4046 en las muestras glicosiladas, tenía el valor esperado de 780,3886 en las muestras desglicosiladas, que no coincidía. Las tablas complementarias 2C y D muestran el peso molecular del péptido Phe152-Arg173 con y sin tratamiento con PNGasa F. Se observó que la masa molecular de Asn165 era 1100,5357 en presencia de glicanos, mientras que el valor del ión peptídico se reemplazó a 1101.5211 en las muestras desglicosiladas. Esto significa que el aumento de 1 Da se debió a la conversión de Asn a Asp. En conjunto, los datos de LC-MS/MS sugieren que la rpS3 secretada está N-glicosilada en Asn165, no en Asn22. Sin embargo, Asn57 sigue siendo incierto porque no se detectó su fragmento. Además, el resultado de la glicosilación en el sitio Asn165 de la proteína rpS3 se confirmó exactamente mediante un ensayo de inmunotransferencia después del aislamiento de la glicoproteína con FLAG-rpS3 o FLAG-N165G expresado de manera estable.células Asn165 es el sitio de N-glicosilación para la secreción de rpS3 Para examinar más a fondo el efecto de los sitios de N-glicosilación en la secreción de rpS3, los sitios de N-glicosilación de rpS3 se modificaron mediante mutagénesis dirigida al sitio. RpS3 de tipo salvaje y los mutantes (N57G mutado en Asn57, N165G mutado en Asn165 y NNGG como doble mutaciónen Asn57 y Asn165) luego se transfectaron de manera estable en células HT1080. Los lisados celulares y los medios de cultivo celular concentrados se analizaron mediante inmunotransferencia con los anticuerpos indicados en La tasa de expresión de mutantes de rpS3 a rpS3 de tipo salvaje se determinó mediante exploraciones de densitometría. Los experimentos se repitieron cuatro veces. En los lisados celulares, excepto en el mutante NNGG, la expresión de los mutantes N57G y N165G fue comparable a la del tipo salvaje. Además, en nuestro estudio anterior [31], confirmamos que la proteína de choque térmico 90 (Hsp90) regula la estabilidad de rpS3 al unirse a los extremos N y C de la proteína rpS3. Pero no se determinó el sitio de unión. Entonces, la razón de la disminución de NNGG es la posibilidad de que la unión de la proteína rpS3 y Hsp90 esté relacionada con estos dos dominios (Asn57 y Asn165) de la proteína rpS3. Curiosamente, como se muestra en , el mutante N165G mostró una secreción reducida (aproximadamente 44 %) en comparación con el tipo salvaje. Sin embargo, el mutante N57G mostró una tasa de secreción aún mayor (144 %) que el tipo salvaje. El mutante NNGG había reducido significativamente la expresión y la secreción, lo que sugiere que la secreción reducida se debió a la degradación dentro de la célula. El análisis de la secreción por mutantes y wild type también se llevó a cabo mediante ELISA. Los resultados sugieren que se requiere la N-glicosilación de Asn165, pero no de Asn57, para la secreción de rpS3. La glicosilación de rpS3 está mediada por lo que sugiere que la secreción reducida se debió a la degradación dentro de la célula. El análisis de la secreción por mutantes y tipo salvaje también se llevó a cabo mediante ELISA. Los resultados sugieren que se requiere la N-glicosilación de Asn165, pero no de Asn57, para la secreción de rpS3. La glicosilación de rpS3 está mediada por lo que sugiere que la secreción reducida se debió a la degradación dentro de la célula. El análisis de la secreción por mutantes y tipo salvaje también se llevó a cabo mediante ELISA. Los resultados sugieren que se requiere la N-glicosilación de Asn165, pero no de Asn57, para la secreción de rpS3. La glicosilación de rpS3 está mediada porla migración del cáncer y el fenotipo invasivo Anteriormente confirmamos que el nivel de proteína rpS3 secretada aumenta en las células malignas [7]. Debido a que la rpS3 secretada requiere N-glicosilación, buscamos confirmar si la glicosilación de rpS3 está relacionada con la malignidad del cáncer . La capacidad de migración y la forma de la célula para la invasión se identificaron mediante la cicatrización de heridas y ensayos de cultivo tridimensionales (3D) con rpS3 de tipo salvaje (FLAG-rpS3) o mutante rpS3 (FLAG-N165G). Después de una incubación de 3 días en Matrigel, el mutante N165G rpS3 mostró disminuciones notables en la glicosilación. Las células N165G tenían una forma redonda, mientras que las células que expresaban FLAG-rpS3 mostraban una alineación direccional en sus bordes delanteros. ElEl ensayo de curación de heridas mostró que la mutación N165G de rpS3 había reducido la migración de células cancerosas . Se realizó una incubación de 7 días, como en los ensayos de cultivo 3D, en dos líneas celulares de cáncer maligno: línea celular de fibrosarcoma HT1080 y línea celular de melanoma humano WM-115 después de la eliminación de rpS3 endógeno por ARNsi (si-rpS3/ humano humano). 777 y si-rpS3/796). La disminución de los niveles de proteína rpS3 en las células indujo cambios en la morfología de las células cancerosas malignas invasivas a la de las células normales . Estos resultados sugieren que la glicosilación de rpS3 regula la migración y el fenotipo invasivo del cáncer.células. La secreción y la glicosilación de rpS3 están relacionadas con el fenotipo maligno de las células cancerosas Para confirmar que la rpS3 glicosilada y secretada regula la invasividad de las células cancerosas , identificamos el estado de glicosilación mediante el aislamiento de glicoproteínas, la morfología celular mediante un ensayo de cultivo 3D después de confirmar el estado de secreción de la proteína rpS3 en una línea celular normal (fibroblastos dérmicos humanos, HDF), fibroblastos embrionarios inmortalizados de ratón NIH3T3 y una línea celular de cáncer de leucemia (fibroblastos de sangre periférica de rata RBL-2H3). La secreción de RpS3 aumentó en las células RBL-2H3 y la glicosilación aumentó en las células RBL-2H3 y HT1080, pero no en la línea celular inmortalizada. Además, la invasividad de las líneas celulares RBL-2H3, HT1080 y WM-115, que son líneas celulares cancerosas agresivas , aumentó drásticamente en comparación con HDF, una línea celular normal y NIH3T3, una línea celular menos agresiva . Especialmente, la línea celular normal HDF, que mostraba un fenotipo celular no invasivo, no secretaba rpS3 o rpS3 glicosilada. Estos resultados sugieren que las proteínas rpS3 glicosiladas y secretadas están relacionadas con fenotipos celulares invasivos como las células cancerosas malignas.