Revista de Termodinámica y Catálisis
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abstracto

La hidrofobicidad reducida del bucle de intercalación del surco menor es crítica para la catálisis eficiente por la uracil-DNA N-glucosilasa adaptada al frío del bacalao del Atlántico

Elin Moe, Netsanet Gizaw Assefa, Ingar Leiros, Kathrin Torseth, Arne O Smalås y Nils Peder Willassen

) en uracil-DNA N-glicosilasas (UNG) sufre cambios conformacionales significativos tras la interacción del sustrato. Estudios previos han demostrado que el bacalao del Atlántico adaptado al frío UNG (cUNG) posee una eficiencia catalítica diez veces mayor que la UNG humana (hUNG). Una alineación de secuencias de las dos enzimas reveló sustituciones de aminoácidos en y cerca del bucle de leucina de cUNG que pueden aumentar la elasticidad del bucle y explicar así la mayor eficacia catalítica observada de cUNG en comparación con hUNG. Para investigar esta hipótesis, construimos cinco mutantes únicos y cuatro múltiples de cUNG con sustituciones de UNG humano de bacalao y los caracterizamos mediante experimentos cinéticos a tres temperaturas diferentes (15, 22 y 37 °C) y calorimetría diferencial de barrido (DSC). . Los resultados mostraron que las mutaciones afectaron a la kcat más que a la KM, y los mutantes con propiedades hidrofóbicas aparentemente reducidas (A266T, V267A, A266T/V267A y A266T/V267A/A274V) mostraron una kcat aumentada o equivalente a cUNG, mientras que las mutantes con una hidrofobicidad aumentada prevista (A274V, H275Y, L279F, A266T/V267A/A274V/H275Y y A266T/V267A/A274V/H275Y/H250Q) mostraron kcat reducido en comparación con cUNG. Por lo tanto, imitar la composición de aminoácidos del bucle de leucina en hUNG reduce la actividad de cUNG. Los experimentos de DSC se realizaron para identificar un aumento potencial en la estabilidad general de los mutantes como resultado de la alteración de la hidrofobicidad del bucle de leucina. Sin embargo, los resultados mostraron una ligera reducción en la estabilidad general de los mutantes con kcat aumentado y una mayor estabilidad para los mutantes con kcat reducido. Sugerimos que estos resultados surgen de la necesidad de compensar una posible elasticidad aumentada/reducida del bucle de leucina que se introduce por las sustituciones de aminoácidos. Este estudio confirma la importancia sugerida del bucle de leucina para la catálisis eficiente de UNG y muestra que es posible alterar la capacidad catalítica de esta enzima manipulando la composición de aminoácidos de este bucle.