Revista de glucómica y lipidómica
Acceso abierto

abstracto

Quantification of Lipids: Model, Reality, and Compromise

Spiro Khourey

Los lípidos son moléculas clave en varios procesos biológicos, por lo que su cuantificación es un punto crucial en muchos estudios y debe tenerse en cuenta en el desarrollo de la lipidómica. Esta familia es compleja y presenta una diversidad de estructuras muy grande, por lo que analizar y cuantificar toda esta diversidad es un verdadero reto. En esta revisión se presentarán las diferentes técnicas para analizar lípidos: desde la resonancia magnética nuclear (RMN) hasta la espectrometría de masas.(con y sin cromatografía) incluyendo detectores universales. En primer lugar, se presentará el estado del arte de la cuantificación, con las definiciones de términos y la estandarización de protocolos, teniendo en cuenta la lipidómica cuantitativa, y luego las consideraciones técnicas y las limitaciones de las herramientas de química analítica, como RMN, espectrometría de masas .y detectores universales, serán discutidos, particularmente en términos de cuantificación absoluta. Los lípidos representan una clase grande y compleja de pequeñas moléculas hidrofóbicas y anfipáticas con una gran diversidad estructural (p. ej., varias combinaciones de acilos grasos y grupos de cabeza funcionales en los fosfolípidos). Se pueden dividir en ocho grupos básicos según el Lipid Mapsconsortium: acilos grasos, glicerolípidos, glicerofosfolípidos, esfingolípidos, lípidos de esteroles, prenolípidos, sacarolípidos y policétidos. Cambios en el nivel y/o en la composición de especies de lípidosy/o clases ocurren después de la perturbación o durante varios procesos fisiológicos. Por lo tanto, es importante poder perfilar el lipidoma con una anotación seria y determinar la abundancia absoluta o relativa de uno, varios o todos los lípidos presentes en la muestra de interés. Sin embargo, la heterogeneidad química de los lípidos, la presencia de muchas especies isoméricas e isobáricasy el amplio rango de concentración en el que se encuentran los lípidos impide la medición de perfiles completos de lipidomas con un solo método analítico y dificulta en gran medida la cuantificación de esta familia. Cada clase (familia) de lípidos, especialmente los lípidos complejos, como los esfingolípidos o los glicerofosfolípidos, presentan un gran número de especies moleculares, lo que dificulta su cuantificación absoluta. Afortunadamente, algunos procesos están disponibles para cuantificar estas moléculas pero con algunas limitaciones. El objetivo de esta revisión es recorrer las diferentes técnicas propuestas: detectores universales como Corona-CAD (detector de aerosol cargado) y ELSD (detector de dispersión de luz evaporativa), NMR(resonancia magnética nuclear) y MS (espectrometría de masas) con o sin separación cromatográfica, y discutir sus ventajas y limitaciones para la cuantificación de lípidos. El análisis cuantitativo de lípidos se ha expandido rápidamente en las dos últimas décadas junto con los avances en tecnologías como MS y NMR, y el número de métodos publicados relacionados con esto sigue creciendo. Sin embargo, se deben tomar algunas precauciones junto con el proceso de bioanálisis para obtener un resultado preciso, especialmente cuando se trata de cuantificación absoluta, es decir, asignar una cantidad o concentración a partir de la respuesta analítica. Cualquiera que sea el propósito del estudio (-ómicos, toxicológicos, farmacéuticos, etc.), los métodos bioanalíticos cuantitativos son fundamentales para la interpretación de los resultados, lo que subraya la necesidad de contar con procedimientos de validación universales. De este modo, dos talleres fueron realizados en 1990 y 2000 por agencias reguladoras y comunidades científicas para armonizar los procedimientos de validación y definir los principales parámetros de validación con sus criterios de aceptación. Varios lineamientos resultaron de estos talleres, donde se detallan metodologías y criterios de aceptación para cada parámetro de validación. De hecho, sugieren usar estándares de referencia enriquecidos en la misma matriz de los estudios previstos para establecer la curva de calibración y las muestras de control de calidad. Estos calibradores y control de calidad deben extraerse con el mismo protocolo que las muestras estudiadas y utilizando un estándar interno, que debe ser el más cercano a los analitos. Este último punto es fundamental, sobre todo cuando se habla de cuantificación absoluta. Para los lípidos, podemos distinguir dos casos: los lípidos simples; tales como esteroles y ácidos grasos con sus derivados, y los lípidos complejos; tales como esfingolípidos, glicerolípidos o glicerofosfolípidos. En el primer caso, se dispone de estándares analíticos puros para preparar curvas de calibración. En el segundo caso, cientos de moléculaslas especies de cada familia pueden detectarse para lípidos complejos en una muestra biológica. En la actualidad, 9856 especies se enumeran en el sitio web de glicerofosfolípidos de Lipid Maps y solo alrededor de 80 estándares analíticos están disponibles comercialmente. Lo mismo ocurre con los esfingolípidos: se pueden encontrar 4411 especies en el sitio web de Lipid Maps y muy pocas especiesestán disponibles. En estas circunstancias, no podremos obtener curvas de calibración para cada especie molecular, y como sabemos que la detección es sensible a la naturaleza de la molécula (especialmente con ácidos grasos), la cuantificación absoluta no será posible. Además, se debe realizar un proceso de validación completo antes de los ensayos, incluida la evaluación de la selectividad, el rango de concentración de la curva de calibración, la exactitud, la precisión, la recuperación y la sensibilidad. Además, se recomienda que los ensayos se validen de forma rutinaria mediante la realización de una nueva curva de calibración extraída y/o una serie de muestras de control cualitativo todos los días. Estos pasos de validación pueden ser muy exigentes cuando se deben analizar varios analitos, con diferentes propiedades fisicoquímicas, en la misma serie. que implican tediosos pasos de preparación y extracción de muestras. Además, estas directrices están dirigidas principalmente a aplicaciones farmacéuticas y toxicológicas, lo que implica que se establecen principalmente para la cuantificación de compuestos exógenos en matrices biológicas. En el caso de los estudios lipidómicos, donde los compuestos de interés son endógenos, la cuantificación absoluta se puede lograr mediante un método de adición estándar, utilizando matrices sustitutas o mediante dilución isotópica cuando los lípidos se detectan mediante espectrometría de masas. Sin embargo, los estándares analíticos de lípidos no están disponibles comercialmente en la mayoría de los casos, lo que significa que solo se podría aplicar la cuantificación relativa, es decir, comparar la cantidad del analito con un analito de referencia. estas directrices están dirigidas principalmente a aplicaciones farmacéuticas y toxicológicas, lo que implica que se establecen principalmente para la cuantificación de compuestos exógenos en matrices biológicas. En el caso de los estudios lipidómicos, donde los compuestos de interés son endógenos, la cuantificación absoluta se puede lograr mediante un método de adición estándar, utilizando matrices sustitutas o mediante dilución isotópica cuando los lípidos se detectan mediante espectrometría de masas. Sin embargo, los estándares analíticos de lípidos no están disponibles comercialmente en la mayoría de los casos, lo que significa que solo se podría aplicar la cuantificación relativa, es decir, comparar la cantidad del analito con un analito de referencia. estas directrices están dirigidas principalmente a aplicaciones farmacéuticas y toxicológicas, lo que implica que se establecen principalmente para la cuantificación de compuestos exógenos en matrices biológicas. En el caso de los estudios lipidómicos, donde los compuestos de interés son endógenos, la cuantificación absoluta se puede lograr mediante un método de adición estándar, utilizando matrices sustitutas o mediante dilución isotópica cuando los lípidos se detectan mediante espectrometría de masas. Sin embargo, los estándares analíticos de lípidos no están disponibles comercialmente en la mayoría de los casos, lo que significa que solo se podría aplicar la cuantificación relativa, es decir, comparar la cantidad del analito con un analito de referencia. la cuantificación absoluta se puede lograr a través de un método de adición estándar, usando matrices sustitutas o usando dilución isotópica cuando los lípidos se detectan mediante espectrometría de masas. Sin embargo, los estándares analíticos de lípidos no están disponibles comercialmente en la mayoría de los casos, lo que significa que solo se podría aplicar la cuantificación relativa, es decir, comparar la cantidad del analito con un analito de referencia. la cuantificación absoluta se puede lograr a través de un método de adición estándar, usando matrices sustitutas o usando dilución isotópica cuando los lípidos se detectan mediante espectrometría de masas. Sin embargo, los estándares analíticos de lípidos no están disponibles comercialmente en la mayoría de los casos, lo que significa que solo se podría aplicar la cuantificación relativa, es decir, comparar la cantidad del analito con un analito de referencia.