Bioquímica y Farmacología: Acceso abierto
Acceso abierto

abstracto

Regulación del reconocimiento de ubiquitina mediada por fosforilación

Julio T Dongdem

La ubiquitina es una importante proteína de señalización celular en eucariotas. Los estudios realizados en los últimos años han demostrado que la ubiquitina puede modificarse por sí misma mediante fosforilación, lo que modula aún más sus funciones reguladoras; sin embargo, no está claro el significado fisiológico (y patológico) total de tales modificaciones adicionales, por ejemplo, en la vía PINK1-Parkin durante el aclaramiento mitocondrial dañado. Además, sin sustrato o ‘sin anclaje’ También se ha identificado que las cadenas de poliubiquitina desempeñan funciones esenciales, como en la vía NF-kB, pero se desconoce si se modifican por fosforilación. La investigación actual se basa en la hipótesis de que, además de las proteínas parkina caracterizadas, NDP52 y OPTN, existen otras proteínas de unión a ubiquitina y dominios de unión a ubiquitina no descubiertos que pueden diferenciar la ubiquitina no modificada de la fosforilada. Además, el proyecto plantea la hipótesis de que las cadenas de poliubiquitina no ancladas (sin sustrato) están reguladas por fosforilación. Por lo tanto, esta investigación está diseñada para catalogar proteínas efectoras de mamíferos con selectividad por fosfo-Ser65-ubiquitina y determinar si las cadenas de poliubiquitina no ancladas también están reguladas por fosforilación. Se empleó cromatografía de afinidad con ubiquitina y fosfo-Ser65-ubiquitina Sepharose para purificar proteínas de células NSC-34 en un tampón seleccionado y se exploró más en la corteza cerebral porcina. Las proteínas unidas se eluyeron de las perlas, se resolvieron mediante SDS-PAGE y se analizaron mediante tinción con plata, transferencia Western e identificaron mediante secuenciación de proteínas basada en LC-MS/MS sin etiquetas. Las cadenas de poliubiquitina no ancladas endógenas de las células HEK293T se purificaron mediante cromatografía de afinidad de dominio ZnF-UBP. Proporcionamos evidencia de que las enzimas desubiquitinantes USP5, USP3 y UCHL1 de las células NSC-34 se unen preferentemente a la ubiquitina no modificada en comparación con la ubiquitina fosfo-Ser65, mientras que HDAC6 no lo hace. Los mutantes de ubiquitina de tipo salvaje, fosfomiméticos (S65D y S65E) y de control (S65A) se generaron con éxito como proteínas recombinantes en E. coli como alternativa a la ubiquitina pSer65 disponible comercialmente y se confirmó la unión reducida de USP5 y UCHL1. Los análisis de LC-MS/MS sugirieron varias proteínas potencialmente novedosas que se regulan de manera diferencial mediante unión no covalente con ubiquitina y/o fosfo-Ser65-(poli)ubiquitina. Además, se detectaron mayores niveles de cadenas de poliubiquitina no ancladas en células HEK293T tratadas con MG-132 en comparación con el control y estas contenían enlaces Lys48. Mostramos que la poliubiquitina no anclada purificada de las células HEK293T tratadas con CCCP se fosforila en Ser65.