Revista de Investigación y Desarrollo
Acceso abierto
ISSN: 2311-3278
ISSN: 2311-3278
silvia martina ferrari
Introducción
Lenvatinib es un inhibidor de la tirosina cinasa multidirigido oral de los receptores del factor de crecimiento endotelial vascular 1–3, los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos 1–4, PDGFRα, RET y v-kit Hardy-Zuckerman sarcoma felino homólogo de las redes de señalización del oncogén viral implicado en el tumor angiogénesis.
Se han evaluado estudios in vitro de lenvatinib en modelos preclínicos. Lenvatinib disminuyó la autofosforilación de KIF5B-RET, CCDC6-RET y NcoA4-RET, al inhibir la proliferación de líneas celulares de cáncer de pulmón y tiroides humano CCDC6-RET y bloqueó la tumorigenicidad de las células NIH3T3 transformadas por fusión del gen RET.
Estudios de fase II y fase III in vivo en pacientes con CDT agresivo que no responde al yodo radioactivo han demostrado que la administración de lenvatinib está asociada con una mejora en la supervivencia libre de progresión en comparación con el placebo. Tras los resultados de este estudio de fase III, lenvatinib ha sido aprobado para el tratamiento de pacientes con DTC localmente recurrente o metastásico, progresivo, refractario al yodo radiactivo.
En el presente estudio, nuestro objetivo fue evaluar la actividad antineoplásica de lenvatinib en líneas celulares ATC continuas y en cultivos celulares ATC primarios, tanto in vitro como in vivo.
Materiales y Métodos
Químicos y suplementos
Lenvatinib se evaluó en cultivos de células ATC primarias, en células 8305C y células AF, y en células AF en ratones CD nu/nu. Los productos químicos y los suplementos se obtuvieron de Sigma-Aldrich. El medio RPMI-1640 se adquirió de Gibco. Los reactivos de PCR para PCR cuantitativa se adquirieron de Applied Biosystems.
tejidos tiroideos
Se recolectaron quirúrgicamente muestras de tiroides de los 9 pacientes ATC y de 5 sujetos sanos sometidos a paratiroidectomía. El diagnóstico se realizó sobre la base de criterios clínicos e histológicos por un laboratorio reconocido. Por inmunohistoquímica se demostró que el receptor de TSH, el simportador de sodio, la tiroperoxidasa y la tiroglobulina no se expresaban en los tejidos tiroideos.
Cultivos celulares Cultivos de células ATC primarias humanas Cultivo de células foliculares de tiroides Línea celular AF Evaluación de la viabilidad y proliferación celular Apoptosis: Ensayo de absorción de Hoechst y unión de anexina V Pruebas de migración e invasión Pruebas ELISA en células ATC Ensayo basado en células de inhibición de fosfo-EGFR ERK1/2 y Akt ELISA La expresión de la proteína Cyclin D1 se cuantifica en células ATC tratadas con lenvatinib Estudios in vivo
animales y tratamiento
Se alojaron ratones CD nu/nu machos de seis semanas de edad, proporcionados por Envigo, en jaulas con microaisladores en rejillas ventiladas y se manipularon utilizando técnicas asépticas. El alojamiento y los procedimientos que involucran animales se realizaron de acuerdo con el protocolo aprobado por la Organización Académica Responsable del Bienestar Animal de la Universidad de Pisa, de acuerdo con la ley italiana D.lgs. 26/2014, y con la aprobación del Ministerio de Salud italiano.
Tejido tumoral: inmunohistoquímica y determinación de densidad de microvasos
Las muestras neoplásicas de los dos grupos de tratamiento se pesaron, luego se fijaron en formalina y posteriormente se incluyeron en parafina. Las secciones de 5 µm de espesor se tiñeron con hematoxilina y eosina, como se describió anteriormente.
análisis estadístico
Se realizaron experimentos por triplicado de cada sujeto y se informó la media de las muestras para las células TFC y ATC. Se usaron ANOVA unidireccional y la prueba U de Mann-Whitney para comparar los valores medios de los grupos para las variables distribuidas normalmente. Se utilizó la prueba de la χ 2 para comparar las proporciones de los grupos. Las comparaciones post hoc sobre variables distribuidas normalmente se realizaron mediante la prueba de Bonferroni-Dunn.
Resultados
Estudios in vitro en células ATC
Evaluación de la proliferación celular
Los datos obtenidos del ensayo WST-1 en células TFC después del tratamiento con lenvatinib demostraron una reducción leve pero significativa en la tasa de proliferación frente al grupo de control tanto a 1 h con lenvatinib 10 µM, 25 µM y 50 µM como a 2 h con lenvatinib 10 µM , 25 µM y 50 µM. El conteo de células confirmó estos resultados: después de 1 h, el número de células fue de 10.150±620/100 µl/pocillo en el control TFC; 9642±1100 (95 %) con lenvatinib 10 µM; 9238±960 (91 %) con lenvatinib 25 µM; y 8625±950 (85%) con lenvatinib 50 µM; después de 2 h, el número de células fue de 17.500±820/100 µl/pocillo; 15.925±1.120 (91 %) con lenvatinib 10 µM; 14.874±1.060 (85 %) con lenvatinib 25 µM; y 14.350±980 (82%) con lenvatinib 50 µM.
Proliferación y BRAF
La proliferación se inhibió de manera similar en ATC de tumores en presencia/ausencia de mutación V600E BRAF.
Evaluación de la apoptosis
Lenvatinib es un aumento de células ATC apoptóticas dependiente de la dosis. El ensayo de Anexina V corroboró estos resultados.
Pruebas de migración e invasión
Después de alcanzar la subconfluencia, los cultivos celulares ATC primarios se trataron con concentraciones crecientes de lenvatinib. Lenvatinib inhibió la migración y la invasión, según lo evaluado por la cámara Transwell.
Inhibición de EGFR
Lenvatinib disminuyó de forma significativa y dependiente de la dosis por la forma fosforilada de EGFR en lisados de células ATC.
Inhibición de la fosforilación de Akt o ERK1/2
Las proteínas Akt o ERK1/2 fosforiladas/no fosforiladas en las muestras tratadas con lenvatinib se redujeron significativamente en los cultivos de células ATC.
Lenvatinib reduce los niveles de proteína ciclina D1
Lenvatinib redujo las concentraciones de ciclina D1 en comparación con las células tratadas con vehículo.
Estudios in vitro en células 8305C y AF
Lenvatinib tuvo una actividad antiproliferativa dependiente de la dosis en células 8305C y en células AF. Después de la exposición a lenvatinib 10 µM, el 19,8 % de las células sufrieron apoptosis y con lenvatinib 25 o 50 µM, el 25 y el 30,8 % de las células sufrieron apoptosis, respectivamente.
Estudios in vivo Lenvatinib reduce el crecimiento tumoral de FA sin pérdida de peso
Lenvatinib redujo significativamente el crecimiento tumoral, desde el día 7 después de iniciado el tratamiento, en comparación con los controles. En particular, no se observó pérdida de peso durante el transcurso del experimento, lo que indica que el tratamiento con lenvatinib fue bien tolerado.
Discusión:
Se están realizando investigaciones sobre los efectos de los inhibidores de la tirosina quinasa para el tratamiento del ATC. En el presente estudio, demostramos que lenvatinib inhibió la proliferación in vitro de cultivos de células ATC primarias, al mismo tiempo que aumentó la apoptosis e inhibió la migración y la invasión. Además, lenvatinib inhibió la proliferación de células 8305C y AF in vitro, al mismo tiempo que aumentó la apoptosis y redujo el crecimiento tumoral de células AF en ratones CD nu/nu sin toxicidad. Estos resultados fueron consistentes con estudios previos que identificaron la capacidad de lenvatinib para inhibir el crecimiento tumoral de líneas celulares ATC in vivo y para interrumpir la angiogénesis al disminuir la permeabilidad vascular.
En el presente estudio, revelamos por primera vez el efecto antitumoral de lenvatinib, un inhibidor de la cinasa multidiana, en cultivos de células ATC humanas primarias obtenidas de pacientes. Estos hallazgos podrían abrir el camino al uso clínico de lenvatinib en el tratamiento de pacientes con ATC.
Nota: Este trabajo se presentó en parte en el 12º Congreso Mundial sobre Ciencias Farmacéuticas e Innovaciones en la Industria Farmacéutica del 26 al 27 de febrero de 2018 en Londres, Reino Unido.