Biología Sintética y de Sistemas Actual
Acceso abierto

abstracto

Síntesis de genes, clonación, expresión, purificación y Caracterización de la ADN polimerasa Bst en células de E. coli

Malarveli Suppan, Shaharum Shamsuddin, Asma Ismail y Venugopal Balakrishnan

La síntesis de genes es una técnica para modificar genes para estudiar la función, la estructura y la expresión de genes. Hay varias estrategias basadas en PCR y estrategias no basadas en PCR para la síntesis de genes. Aquí realizamos la síntesis de genes en 2 pasos que combina PCR de ensamblaje y estrategias de PCR de extensión de superposición secuencial para sintetizar la longitud completa de la polimerasa de ADN Bst (2648 pb) y expresar la proteína en células de E. coli. La polimerasa de ADN Bst de longitud completa se dividió en 5 fragmentos de ADN cortos y los oligonucleótidos se diseñaron para la secuencia completa, cada uno con 40-45 meros. En el paso 1, los oligonucleótidos de cada fragmento se ensamblaron y luego el fragmento del gen se amplificó por separado mediante el método de PCR de ensamblaje. En el paso 2, los dos fragmentos adyacentes se ensamblaron secuencialmente a través de PCR de extensión superpuesta a la vez hasta que el gen de longitud completa se sintetizó por completo y finalmente se clonó en el vector pCR®2.1-TOPO. A continuación, el gen pol de ADN de Bst de longitud completa se subclonó en el vector de expresión pET28a(+) y finalmente se expresó en células BL21(DE3) de E. coli. La proteína purificada se identificó mediante análisis MALDITOF. La actividad de polimerización de la ADN polimerasa de Bst recombinante se comparó con la enzima comercial. La polimerasa de ADN de Bst recombinante de 98 kDA logra la amplificación de un fragmento de ADN de 100 pb a través de la amplificación dependiente de helicasa (HDA).