Revista de Proteómica y Bioinformática
Acceso abierto

abstracto

Optimización de la identificación de péptidos citrulinados por espectrometría de masas: utilización de la incapacidad de la tripsina para escindirse después de los aminoácidos citrulinados

Mar Bennike, Kasper B. Lauridsen, Michael Kruse Olesen, Vibeke Andersen, Svend Birkelund y Allan Stensballe

Las proteínas citrulinadas se han asociado con varias enfermedades y la citrulinación probablemente puede funcionar como un objetivo para nuevos agentes de diagnóstico y desentrañar etiologías de la enfermedad. Por lo tanto, la identificación correcta de las proteínas citrulinadas es de suma importancia. La proteómica impulsada por espectrometría de masas (MS) puede, con estrategias ascendentes, analizar perfiles de proteínas y PTM en muestras complejas. Sin embargo, la caracterización específica del sitio de la citrulinación usando MS sigue siendo problemática, especialmente en muestras complejas donde no existe una técnica de modificación química sensible. Por lo tanto, a menudo se usa una escisión tríptica perdida después de la citrulina como marcador para el procesamiento posterior de la citrulina. Sin embargo, también se han informado péptidos citrulinados trípticos C-terminales. En este estudio, por lo tanto, apuntamos a optimizar la identificación de péptidos citrulinados en muestras complejas. Para evaluar las propiedades de escisión de la tripsina, la digestión se realizó en conjuntos de péptidos sintéticos que contenían arginina o citrulina. Las secuencias peptídicas se originaron a partir de proteínas citrulinadas in vivo asociadas a enfermedades; algunos informaron que eran péptidos citrulinados trípticos C-terminales. Además, la actividad proteolítica se verificó utilizando muestras de líquido sinovial digerido de un paciente con artritis reumatoide. Las muestras se analizaron mediante cromatografía líquida/MS en tándem con ionización por electropulverización. Nuestros estudios in vivo e in vitro demuestran claramente la incapacidad de la tripsina para escindir los residuos de citrulina. Con base en nuestros hallazgos, presentamos una estrategia para verificar sitios citrulinados en muestras complejas después del procesamiento, en experimentos de escopeta de proteómica. Al requerir una escisión perdida para la identificación de péptidos citrulinados, demostramos que el 64% de los sitios de citrulinación anotados con falsos positivos podrían eliminarse. Además, demostramos los posibles peligros de aplicar la estrategia. En conclusión, la anotación manual de espectros de péptidos citrulinados sigue siendo esencial para garantizar una anotación correcta. La implementación de un requisito de clivaje perdido reduce significativamente la cantidad de espectros que necesitan verificación manual con una pérdida mínima. Este método puede ayudar a futuros estudios proteómicos a identificar proteínas citrulinadas en muestras complejas.