Revista de Síndromes Genéticos y Terapia Génica
Acceso abierto

abstracto

Tinción inmunofluorescente óptima para el factor IX humano y las células T infiltrantes después de la terapia génica para la hemofilia B

Geoffrey L. Rogers y Brad E. Hoffman

La imagen inmunofluorescente es una herramienta valiosa para investigar el resultado de la terapia génica dentro del tejido transducido. Con una técnica de marcaje múltiple, es posible tanto caracterizar la expresión local del transgén como evaluar la gravedad de la respuesta inmunitaria adaptativa a través de la infiltración de células T citotóxicas. Es fundamental que los parámetros experimentales sean óptimos para evitar malas interpretaciones de eventos patológicos importantes. Para optimizar este protocolo de tinción, se transdujo hígado murino y músculo esquelético usando virus adenoasociado recombinante que codifica el factor IX humano. Después de probar varias técnicas comunes de crioconservación y fijación, descubrimos que la integridad óptima del tejido y la detección del antígeno (factor IX y CD8) se lograban congelando el tejido muscular en isopentano enfriado con nitrógeno líquido (también llamado metilbutano o 2-metilbutano), seguido de fijación con acetona a temperatura ambiente. El protocolo de tinción descrito en este documento requiere solo unas dos horas, pero mantiene una especificidad exquisita incluso a gran aumento bajo microscopía confocal.