Revista de glucómica y lipidómica
Acceso abierto

abstracto

N-Glycan analysis on monoclonal antibodies using MALDI-Q-IT-TOF

Gulce Ozmen

Los anticuerpos monoclonales (MAbs) se utilizan cada vez más para el tratamiento del cáncer u otras enfermedades autoinmunes. La estructura correcta de glicanos de MAb es esencial para la actividad funcional y biológica del Mab relacionado, como la identificación de antígenos activados por células del sistema inmunitario , la regulación de las actividades de señalización y las propiedades fisicoquímicas de los tratamientos producidos, etc. Por lo tanto, el control rápido de la estructura de glicanos es muy crítico. para la producción de medicamentos terapéuticos, la producción de medicamentos biosimilares y sus procesos de control de calidad.

El principal de este estudio es la caracterización de la estructura de glicanos de MAbs. En nuestro estudio, se caracterizó la estructura de glicanos de trastuzumab, utilizado como fármaco para el tratamiento del cáncer de mama. Los N-glucanos se liberaron enzimáticamente de la estructura de la proteína Trastuzumab mediante la digestión con tripsina y la escisión de PNGasa F (péptido: N-glucosidasa F). Además, se utilizaron procedimientos especiales de intercambio de tampones y extracción en fase sólida para fines de limpieza antes de la detección MALDI-TOF-MS (desorción/ionización láser asistida por matriz-tiempo de vuelo-espectrometría de masas).

Después de diseñar el tratamiento y la optimización adecuados de la muestra, los glucanos GO, GOF, G1, G1F, GOF-GN fueron detectados claramente por MALDI-Q-IT-TOF MS sin ningún tipo de etiquetado o utilizando métodos de separación cromatográfica adicionales.

La charla actual trata sobre los aspectos teóricos y experimentales de MALDI-Q-IT-TOF MS para el estudio de glicanos en anticuerpos monoclonales. Se abordarán los procedimientos de preparación de muestras y los consejos para las mediciones de MALDI-TOF-MS y se presentarán los datos originales obtenidos de MALDI-Q-IT-TOF MS.

 La glicosilación es un atributo fundamental para el desarrollo y la fabricación de anticuerpos monoclonales (mAb) terapéuticos en la industria farmacéutica. El análisis convencional de glicanos de anticuerpos generalmente se logra mediante el método de cromatografía líquida de interacción hidrofílica (HILIC) de 2-aminobenzamida (2-AB) después de la liberación de glicanos. Aunque este método produce resultados satisfactorios, tiene un uso limitado para la detección de una gran cantidad de muestras porque requiere reactivos costosos y toma varias horas o incluso días para la preparación de la muestra. No se disponía de un método de análisis de glicanos simple y rápido. Para superar estas limitaciones, nos

Desarrolló y comparó 2 métodos ultrarrápidos para el análisis de glucanos de anticuerpos (UMAG) que implican la generación y purificación rápidas de glucopéptidos .en un disolvente orgánico o en un tampón acuoso, seguido de una cuantificación sin etiquetas mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorción/ionización láser asistida por matriz. Ambos métodos producen rápidamente perfiles de N-glicanos de anticuerpos de prueba similares a los obtenidos por el método 2-AB HILIC-HPLC. Además, el método UMAG realizado en tampón acuoso tiene un tiempo de ensayo más corto de menos de 15 minutos y permite un análisis de alto rendimiento en placas de PCR de 96 pocillos con una manipulación mínima de la muestra. Este método, el más rápido y simple que se ha informado hasta el momento, ha sido evaluado para el perfilado glicosilado de mAbs expresados ​​en diversas condiciones de cultivo celular, así como para la evaluación de clones de cultivos de anticuerpos y varios lotes de producción. Es importante destacar que el método capturó de manera sensible los cambios en los perfiles de glicosilía detectados por 2-AB HILIC-HPLC o HILIC-UPLC tradicionales.

(MALDI), se ha desarrollado una trampa de iones cuadrupolo (QIT) y un espectrómetro de masas (MS) de tiempo de vuelo (reToF) de Reflectron. Se han llevado a cabo simulaciones por computadora para modelar diferentes métodos para introducir de manera eficiente iones MALDI en el QIT y para posteriormente extraer iones del QIT a un reToF sin rejilla de dos etapas. Los parámetros del sistema se optimizaron para acercarse al 100 % de eficiencia de captura y la resolución de masa más alta. Se construyó un instrumento prototipo para lograr el rendimiento previsto a partir de las simulaciones por computadora. Se desarrollaron métodos para la irradiación láser casi ortogonal de una muestra, la conmutación rápida de voltajes de radiofrecuencia (RF) de gran amplitud y un reflectrón de dos etapas sin rejilla.ⁿ ) análisis. Se han obtenido espectros de masas elevados para m/z hasta 16.000 y  se han llevado a cabo con éxito experimentos de MS ^{3 .} Se ha logrado una sensibilidad de 0,1 fmol a una resolución de masa superior a 3.000.

Los anticuerpos monoclonales (mAb) terapéuticos son glicoproteínas producidas por sistemas de células vivas. Los restos de glicano unidos a las proteínas pueden afectar directamente la estabilidad, la bioactividad y la inmunogenicidad de las proteínas. Por lo tanto, las variantes de glucano de un producto de glicoproteína deben analizarse y controlarse adecuadamente para garantizar la calidad del producto. Sin embargo, la complejidad inherente de la glicosilación de proteínas plantea un desafío analítico abrumador. Esta revisión proporciona una actualización de los avances recientes en el análisis de glucanos, incluida la utilidad potencial de micromatrices basadas en lectina para la elaboración de perfiles de glucanos de alto rendimiento. Se hace hincapié en la comparación de los principales tipos de análisis para su uso en la determinación de características únicas de glicanos, como el sitio de glicosilación, la estructura y el contenido de glicanos.

Biografía

Recibió su título BSC en Bioquímica, Facultad de Ciencias de la Universidad de Ege en 2006. Actualmente está haciendo su tesis de maestría sobre "Análisis de glicanos de anticuerpos monoclonales" y se graduará en el verano de 2017. Al mismo tiempo se desempeña como investigadora científica en el Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos y Aplicaciones Farmacocinéticas (ARGEFAR) desde 2008. Su experiencia profesional incluye el uso de técnicas HPLC, LC MS, MALDI TOF MS. Su interés de investigación abarca la caracterización fisicoquímica de fármacos biosimilares y biofarmacéuticos.