Inmunoterapia: Acceso Abierto
Acceso abierto

abstracto

Inmunohistoquímica multiplex: la importancia del orden de tinción al producir un protocolo validado

Jihad Syed, Jack Ashton, Jesuchristopher Joseph, Gemma N Jones, Christian Slater, Alan Sharpe, Garry Ashton, William Howat, Richard Byers, Helen K Angell

Objetivo: La complejidad de las enfermedades multifactoriales, como el cáncer, plantea importantes desafíos para el desarrollo de terapias personalizadas. El análisis histológico digital integrado de los tumores proporciona una mejor comprensión del microambiente inmunitario y la relación pronóstica asociada con la enumeración y distribución de subpoblaciones específicas de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL). En este sentido, el etiquetado de células multiplex, junto con las imágenes multiespectrales (MSI), es un enfoque cada vez más utilizado para lograr una cuantificación y un fenotipado de TIL in situ más precisos. Sin embargo, estos enfoques requieren una validación completa antes de su utilización, que es el objetivo fundamental de este estudio.

Métodos: Se usaron secciones completas y micromatrices de tejido rico en linfocitos para desarrollar y validar un protocolo de inmunofluorescencia (IF) multiplex para el interrogatorio MSI simultáneo de hasta seis antígenos de células inmunitarias de interés; CD3, CD8, FOXP3, CD20, PD-L1 y PD1. Primero se logró la concordancia entre la inmunohistoquímica cromogénica (IHC) de un solo complejo y la tinción de inmunofluorescencia (IF) de un solo complejo. Posteriormente, se investigó el efecto de la posición en una orden de IF multiplex para cualquier anticuerpo dado, comprendiendo el impacto del impedimento estérico del anticuerpo y las condiciones de eliminación de anticuerpos.

Resultados: En los métodos en los que se permite la multiplexación mediante la recuperación de antígenos para eliminar los anticuerpos anteriores, el principal factor de composición que influyó en la validación del ensayo multiplex fue el efecto no lineal y no uniforme de los tiempos prolongados de calor -recuperación de epítopo inducida (HIER), a medida que los anticuerpos avanzan en orden en un protocolo multiplex.

Conclusión: este estudio demuestra la fidelidad de la tinción multiplex como representante de la tinción singleplex, el efecto del orden de la tinción de anticuerpos y ofrece un marco para la generación de protocolos inmunofluorescentes multiplex optimizados.< /p>