Revista de química física y biofísica
Acceso abierto

abstracto

MJK2, un canal K+ de M. Jannaschii media la actividad de transporte de potasio dependiente del pH

Carsten Zeilinger

MjK2 se expresó en E. coli como una proteína de fusión que contiene un sitio de unión al anticuerpo N- o C-terminal y un hexámero de histidina. La proteína de fusión con etiqueta C-terminal permite la expresión y la purificación de un dominio RCK extrasoluble en p34 kDa, mientras que este dominio RCK adicional se perdió cuando se usó la construcción etiquetada N-terminal. Tras la eliminación del péptido de fusión del monómero de canal etiquetado N-terminal purificado, MjK2 apareció como un tetrámero estable cuando se incubó con lípido sintético. La actividad del canal se estudió después de la reconstitución en liposomas mediante el registro de un solo canal o mediante un ensayo óptico con el colorante de detección de potasio, PBFI. Primero, la función del canal se mejoró mediante la grabación de un solo canal. El registro de un solo canal confirmó la dependencia del pH de la actividad del canal con conductancias de un solo canal de 42, 70, 85 y 202 pS e indicó que se formó un canal de K+ funcional. Para estudiar la función de la actividad de MjK2 reconstituida en un ensayo óptico, se inició la liberación de potasio cuando el bloqueo externo de BaCl2 se compensó mediante la adición de EDTA. La liberación de potasio estuvo mediada por MjK2 reconstituido a pH bajo o por la presencia de calcio interno a pH alto. El MgCl2 no tuvo ningún efecto o tuvo un efecto débil, mientras que el AMPc a pH bajo provocó una pérdida completa de potasio durante la preparación. Los estudios de alineación revelaron que MjK2 tiene diferentes características estructurales en el poro del canal y la composición de RCK y, por lo tanto, se puede esperar una función diferente. La secuencia de aminoácidos y los alineamientos estructurales mostraron que un sitio de unión de Ca2+ y un sitio de unión de nucleótidos típico no están presentes en el dominio RCK de MjK2 y, por lo tanto, podría esperarse un comportamiento diferente. Además, una región conectora de alcance de lisina, como la que se encuentra en los canales de K+ del esperma humano hslo1 y hslo3, puede desempeñar un papel similar en el comportamiento de activación.