Revista de glucómica y lipidómica
Acceso abierto
ISSN: 2153-0637
ISSN: 2153-0637
Anna Meljón
La deficiencia en el citocromo P450 (CYP) 7B1, también conocido como oxisterol 7α-hidroxilasa, en humanos conduce a paraplejía espástica hereditaria tipo 5 (SPG5) y, en algunos casos, a enfermedad hepática en bebés. SPG5 se caracteriza médicamente por la pérdida de neuronas motoras en el tracto corticoespinal. En un esfuerzo por obtener una mejor comprensión de la bioquímica fundamental de este trastorno, hemos ampliado nuestro perfil anterior del contenido de oxisterol del cerebro y el plasma de ratones knockout para Cyp7b1 (-/-) para incluir, entre otros esteroles, 25-hidroxilado metabolitos del colesterol. Aunque los niveles de colesterol cerebral no difieren entre los ratones de tipo salvaje (wt) y los knockout, encontramos, utilizando una metodología de etiquetado de carga en combinación con cromatografía líquida-espectrometría de masas(LC-MS) y fragmentación multietapa (MSn), que hay una acumulación del sustrato CYP7B1 25-hidroxicolesterol (25-HC) en el cerebro y el plasma del ratón Cyp7b1-/-. Como se informó anteriormente, los niveles de (25R)26-hidroxicolesterol (26-HC), ácido 3β-hidroxicolesterol-5-en-(25R)26-oico y 24S,25-epoxicolesterol (24S,25-EC) están igualmente elevados en cerebro y plasma. Se sabe que los oxiesteroles de cadena lateral, incluidos 25-HC, 26-HC y 24S,25-EC, se unen a INSIG (gen inducido por insulina) e inhiben el procesamiento de SREBP-2 (proteína 2 de unión al elemento regulador de esteroles) a su forma activa como principal regulador de la biosíntesis del colesterol. Sugerimos que la concentración de colesterol en el cerebro del ratón Cyp7b1-/- se mantenga equilibrando el metabolismo reducido, como consecuencia de una pérdida en CYP7B1, con biosíntesis reducida. El ratón Cyp7b1-/- no muestra ningún defecto motor; si el defecto en los seres humanos es una consecuencia de menos eficientela homeostasis del colesterol en el cerebro aún no se ha descubierto. El citocromo P450 (CYP) 7B1 ( miembro 1 de la subfamilia B de la familia 7 del citocromo P450) se identificó por primera vez en 1995 y se descubrió que se expresaba principalmente en el cerebro de los roedores. CYP7B1 es una 7α-hidroxilasa de oxisterol y esteroide, que acepta muchos oxiesteroles y ácidos de colesterol como sustratos, así como esteroides.incluyendo dehidroepiandrosterona (DHEA). En humanos, la deficiencia de la enzima se reveló por primera vez en un niño de diez semanas que presentaba una enfermedad hepática grave. En estudios más recientes, el tratamiento de otro lactante con esta deficiencia enzimática con ácido quenodesoxicólico ha resultado exitoso en la resolución de la enfermedad hepática [6]. CYP7B1 se expresa en el hipocampo humano y, curiosamente, el ARNm de CYP7B1 se reduce significativamente en las neuronas dentadas de sujetos con enfermedad de Alzheimer. En ratones, la eliminación de Cyp7b1 da como resultado un fenotipo leve a pesar de la elevación de los niveles plasmáticos y tisulares de sus sustratos de oxisterol 25-hidroxicolesterol (25-HC) y 26-hidroxicolesterol, presumiblemente el epímero 25R (26-HC, también conocido como 27 -hidroxicolesterol, consulte Materiales complementarios, Tabla S1 para abreviaturas, nombres comunes y sistemáticos) [8]. A la luz de estos datos del ratón, fue sorprendente cuando Tsaousidou et al. encontraron en 2008 que las alteraciones de secuencia en CYP7B1 estaban asociadas con paraplejia espástica hereditaria tipo 5 (SPG5) en humanos [9]. Estudios posteriores han confirmado que los pacientes que padecen SPG5 tienen un fenotipo metabólico característico de CYP7B1 inactivo. En un esfuerzo por comprender las diferencias entre ratones y humanos con respecto a la CYP7B1 defectuosa, nos embarcamos en un estudio esterolómicoinvestigación de cerebro y plasma de ratón que explota la derivatización asistida por enzimas para el análisis de esteroles (EADSA) y cromatografía líquida- espectrometría de masas(LC-MS) con fragmentación multietapa (MSn). Anteriormente encontramos que en el cerebro de ratón con Cyp7b1 knockout (Cyp7b1-/-) la concentración de colesterol era similar a la del tipo salvaje (wt, Cyp7b1+/+), al igual que los niveles de 24S-hidroxicolesterol (24S-HC) [ 14]. Por otro lado, las concentraciones de (25R)26-hidroxicolesterol (26-HC), ácido 3β-hidroxicolesterol-5-en-(25R)26-oico (3β-HCA) y 24S,25-epoxicolesterol (24S,25- EC) estaban elevados, presumiblemente siendo sustratos de CYP7B1. Ahora, profundizando en el esteroloma, revelamos que el 25-HC y el 26-hidroxidesmosterol (26-HD) también están elevados en el cerebro del ratón Cyp7b1-/-, mientras que los 7α,25-dihidroxiesteroles están reducidos en abundancia, pero otros oxiesteroles 24R- hidroxicolesterol (24R-HC), 7α- y 7β-hidroxicolesterol (7α-HC, 7β-HC) no cambian en concentración entre los dos genotipos. Sugerimos que los niveles elevados de 25-HC, 26-HC y 24S,25-EC en el cerebro reducen la expresión de genes biosintéticos de colesterol al inhibir el procesamiento de SREBP-2 (proteína 2 de unión a elementos reguladores de esteroles) a su forma activa como una transcripción maestra para la vía del mevalonato, lo que reduce la síntesis de colesterol y compensa su metabolismo reducido (a través de la vía CYP7B1), manteniendo así los niveles de colesterol en el cerebro del ratón Cyp7b1-/- en niveles de tipo salvaje. Se ha encontrado que 25-HC, 24S, 25-HC, 3β-HCA y, en algunos estudios, 26-HC son ligandos de los receptores X del hígado (LXRα, NR1H3; LXRβ, NR1H2), cuya activación aumenta la expresión del transportador de cassette de unión a ATP A1 (ABCA1) y la apolipoproteína E (APOE), proteínas transportadoras y portadoras importantes para mantener niveles correctos de esteroles en las neuronas [19] y evitar la sobrecarga por oxiesteroles potencialmente tóxicos. Las muestras de cerebro y plasma procedían de ratones macho de 13 y 23 meses de edad. Los ratones Cyp7b1-/- y Cyp7b1+/+ eran compañeros de camada generados a partir de cruces Cyp7b1+/- en las instalaciones para animales de la Universidad de Edimburgo. Todos los ratones se alojaron en condiciones estándar (ciclo de luz/oscuridad de 7:00 a. m. a 7:00 p. m., 21 °C) con alimento y agua disponibles ad libitum. El muestreo de tejido se realizó bajo los auspicios de la Ley de Procedimientos Científicos (Animales) del Reino Unido de 1986, modificada en 2012 para cumplir con la Directiva Europea 2010/63/UE. El estudio se realizó bajo PPL No.70/7870 con la aprobación previa del Organismo de Revisión Ética y Bienestar Animal de la Universidad de Edimburgo. Todos los ratones fueron sacrificados por la mañana por dislocación cervical, Se recolectó sangre del tronco y se extrajeron los cerebros, se congeló en hielo seco en polvo y se almacenó a -80 ° C. Los esteroles, incluidos los oxiesteroles, se extrajeron del cerebro como se describe en. En resumen, el cerebro de ratón se homogeneizó en etanol que contenía estándares internos marcados con isótopos y fracciones ricas en oxiesteroles y colesterol separadas por extracción en fase sólida (SPE) en una columna C18 de fase inversa. A continuación, la fracción rica en oxisterol se dividió en dos alícuotas (a y b) y la primera se trató con la enzima colesterol oxidasa de Streptomyces sp. para oxidar grupos 3β-hidroxi-5-eno a equivalentes de 3-oxo-4-eno, adecuados para la posterior derivatización con el reactivo Girard P (GP) (es decir, fracción a). La segunda alícuota de la fracción de oxisterol se trató directamente con reactivo GP, en ausencia de colesterol oxidasa (es decir, fracción b). Esto permitió diferenciar los oxiesteroles con una estructura nativa de 3-oxo-4-eno (fracción b) de aquellos con una estructura de 3β-hidroxi-5-eno (es decir, (fracción a)–(fracción b)). La fracción rica en colesterol se trató por separado, pero de la misma forma que la fracción rica en oxisterol. Las muestras de plasma se prepararon como se describe en Autio et al. y Crick et al. por extracción en etanol seguido de SPE para separar las fracciones ricas en colesterol y oxisterol. A continuación, los oxiesteroles se derivatizaron con reactivo GP con (fracción a), o sin (fracción b), oxidación previa por colesterol oxidasa. Para el análisis de plasma, se usaron dos reactivos GP [2H0]GP y [2H5]GP con la fracción a o con la fracción b, respectivamente. Esto permitió el análisis LC-MS dúplex de fracciones de oxisterol preparadas con (fracción a) o sin (fracción b) tratamiento con colesterol oxidasa. Las fracciones ricas en oxisterol oxidadas/derivatizadas se analizaron mediante LC-MS (MSn) utilizando un sistema Ultimate 3000 LC (Thermo Fisher Scientific, Loughborough, Reino Unido) y el espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap (Thermo Fisher Scientific, Loughborough, Reino Unido) como se describe en Meljon et al. y Crick et al. . En resumen, los oxiesteroles derivados de GP se separaron en una columna Hypersil Gold C18 de fase inversa (Thermo Fisher Scientific) usando un gradiente de metanol/acetonitrilo/ácido fórmico al 0,1 %. El eluyente se dirigió a una fuente de ionización por electropulverización (ESI) y se analizó mediante MS y MS3 de alta resolución (60 000 a m/z 400) ([M]+→[M-Py]+→, donde "-Py" corresponde a la pérdida del grupo piridina del ion molecular M+) exploraciones realizadas en paralelo en la trampa de iones lineal Orbitrap y LTQ, respectivamente. La cuantificación se realizó mediante el método de dilución de isótopos.