Ingeniería enzimática
Acceso abierto

abstracto

Aislamiento, purificación y caracterización de la estructura secundaria y estudio cinético de la lipasa de la carpa principal india, Catla catla (Catla)

Kameshwar Sharma YVR, Neelima Boora y Prasidhi Tyagi

Las lipasas son enzimas ubicuas que catalizan la hidrólisis de grasas en ácidos grasos y glicerol en la interfase agua-lípido e invierten la reacción en medios no acuosos. Las lipasas ocupan un lugar destacado entre los biocatalizadores debido a sus novedosas y múltiples aplicaciones en oleoquímica, síntesis orgánica, formulación de detergentes y nutrición. La lipasa se extrajo y aisló del tubo digestivo y del tubo digestivo de Catla catla (catla). El tejido se homogeneizó en una proporción de 1:3 con tampón de partida (TrisHCl 0,01 M, pH 7,2). El extracto bruto así obtenido se precipitó con sulfato de amonio (20-80%). El exceso de sal se eliminó mediante diálisis y el dializado resultante (enzima desalinizada) se sometió a una columna de celulosa DEAE para cromatografía de intercambio iónico a un caudal de 0,5 ml/min. La elución se llevó a cabo mediante un gradiente escalonado de NaCl (100-800 mM) en el tampón de partida. Las fracciones activas se agruparon como fracción purificada (PF) y se usaron para la caracterización física del pH, la temperatura y el efecto del calcio en la actividad enzimática, la caracterización estructural, la caracterización molecular y los estudios cinéticos. La Fracción Purificada (PF) mostró una actividad específica final de 1438,72 U/mg. El pH óptimo fue de 7,8 y se encontró que la temperatura óptima era de 20ËšC. El valor de la temperatura de fusión (Tm) fue de 42ºC y la energía de activación de la lipasa purificada fue de 34,82 KJ/mol/K. Se encontró que la estabilidad térmica de la lipasa estaba a 20ËšC. La actividad de la lipasa retuvo hasta 3 h de incubación con 10 mM y 20 mM de CaCl2 en tampón de partida. Esto muestra que el calcio tiene una propiedad potenciadora de la desnaturalización de la enzima. La constante de Michaelis-Menten (Km) de la lipasa de la carpa india mayor, catla para la hidrólisis de pNPP fue de 6,695 mM. El número de recambio (kcat) de lipasa (catla) fue de 0,0022 s-1. La eficiencia catalítica (kcat/Km) de la lipasa fue de 0,0003412 s-1 mM-1. SDS-PAGE de lipasa purificada (PF) reveló una única banda homogénea con una masa molecular de 70 kDa. La disposición estructural secundaria de las hélices α y las hebras β de la lipasa purificada da como resultado un 48,51 % y un 9,74 %, respectivamente, utilizando el dicroísmo circular.