Revista internacional de minería de datos biomédicos
Acceso abierto
ISSN: 2090-4924
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Rajesh Kumar Jha
Abstracto
La implantación de embriones es un procedimiento complejo notable que requiere una comunicación multifacética entre el blastocisto capacitado para unir y un endometrio abierto. El aseguramiento de la receptividad de las células epiteliales luminales del endometrioincluye diferentes cambios básicos y atómicos en la película de plasma y el citoesqueleto. Las integrinas, el término medio de las conexiones de célula a célula y de célula a estructura, están relacionadas con el proceso de implantación del organismo no desarrollado, donde posiblemente controlan la asociación entre el útero y el blastocisto. Durante el embarazo temprano, se ha demostrado que la integrina β8 coopera con el cambio del factor de desarrollo β (TGF-β) en la interfaz feto-materna. En cualquier caso, aún no se aclara el trabajo exacto de la integrina β8 en el útero y su relación con la implantación del organismo no desarrollado. De esta manera, nos esforzamos por descubrir el trabajo de la integrina β8 durante la ventana de un proceso de implantación de un organismo no desarrollado mediante su examen de impedimento de articulación de proteínas.
Además, investigamos el papel de los esteroides ováricosen la articulación de la integrina β8 utilizando la implantación diferida y el modelo de ratones ovariectomizados no preñados. Encontramos que la integrina β8 está dirigida hacia arriba durante la fase de periimplantación temprana de la ventana de implantación de organismos no desarrollados y trasciende a los destinos de la implantación de organismos incipientes de la etapa de periimplantación. El bioequilibrio y el silenciamiento del ARNm de la integrina β8 uterina en la etapa previa a la implantación restringieron la implantación del organismo no desarrollado y el embarazo subsiguiente, lo que recomienda su trabajo urgente durante la implantación del organismo incipiente. La integrina β8 puede controlar el movimiento de sus átomos señalizadores aguas abajo STAT-3, integrina β8, TGF-β1, Vav y Rac-1 en el útero durante la implantación del organismo no desarrollado. La integrina β8 puede controlarse con el esteroide ovárico, 17-β estradiol en progesteronaútero preparado que responde. En esta investigación, hemos explicado el trabajo administrativo clave de la integrina β8 durante la ventana de implantación del embrión.
Introducción
Uno de los grupos clave de receptores de la superficie celular que participan en las cooperaciones célula-MEC son las integrinas. Son glicoproteínas transmembrana heterodiméricas (una subunidad α y una β), que comprenden un enorme espacio extracelular globular, apto en particular para las proteínas ECM y otros receptores de la superficie celular, y un área citoplasmática más pequeña, que se conecta con numerosas proteínas del citoesqueleto y comienza a marcar caídas. . Estas conexiones son significativas en los condrocitos y la condrogénesis, como se muestra en las pruebas que utilizan anticuerpos de bloqueo. Por ejemplo, el bloqueo de la integrina β1 interfiere gravemente con la unión de los condrocitos a la fibronectina, el colágeno tipo II y el colágeno tipo IV, y reprime la condrogénesis. Las integrinas también son significativas en la mejora de la red pericelular y en la desdiferenciación,
Resultado
Se utilizó un desarrollo lentiviral de shRNA para hacer una caída constante de ITGB8, una subunidad de integrina que se sabe que está involucrada con la llegada de TGF-β insoluble de su péptido relacionado con la latencia y, por lo tanto, se cree que es importante en la separación condrogénica. Nuestros primeros ensayos habían demostrado que era una de las pocas subunidades de integrina controladas de manera confiable en la separación condrogénica, prestando poca atención a la estructura del medio o al modelo de condrogénesis. Delinea la efectividad de la caída cuando se elige puromicina. Después de la determinación, la PCR cuantitativa indicó una competencia de silenciamiento del 89 % y la proteína era imperceptible por transferencia Western. Después de la extensión, las células se separaron en el modelo de micromasa de condrogénesis.
La articulación de la subunidad de integrina durante la separación condrogénica generalmente no se vio afectada en la caída de la integrina β8 en contraste con el tipo salvaje. Después de 21 días, no hubo contrastes notables mensurables en las subunidades α. Las subunidades β fueron influenciadas progresivamente, siendo imperceptible la articulación de ITGB3 después de cuatro días. Curiosamente, numerosas subunidades de integrina se mejoraron en las hMSC de eliminación de integrina β8 en el día 0 (antes del desarrollo de la micromasa). De hecho, este impacto fue enorme para ITGA3, ITGA4, ITGA6, ITGA7, ITGA11, ITGAV, ITGB1 e ITGB5 (todos controlados hacia arriba en la caída de ITGB8) e ITGA5 (controlados hacia abajo en la caída de ITGB8).
Todos los marcadores de fenotipo se vieron influidos por la disminución de la integrina β8. ACAN todavía se comunicó solo en medio condrogénico, pero se controló fundamentalmente a la baja en la caída después de 4 días en comparación con las hMSC de tipo salvaje. La articulación COL2A1 tuvo un cambio sorprendente en la caída de la integrina β8, donde no se reconoció en ningún momento. Los dos marcadores de red pericelular, COL6A1 y HSPG2, fueron fundamentalmente dirigidos hacia arriba en contraste con el tipo salvaje tanto en el medio de desarrollo como en el condrogénico, con una guía hacia arriba más prominente en el medio de desarrollo. COL1A1 se controló por completo a la baja en medio condrogénico después de 21 días, pero no se vio afectado en medio de desarrollo. COL10A1 se manejó a la baja en contraste con el tipo salvaje en el medio de desarrollo el día 7, pero se comunicó correspondientemente el día 21. En el medio condrogénico, no se vio afectado por la caída de la integrina β8. La articulación RUNX2 se anuló al reducir la integrina β8 tanto en el medio de desarrollo como en el condrogénico en puntos inigualables. SOX9 se controló fundamentalmente a la baja después de 21 días en medio condrogénico, pero no se vio afectado en medio de desarrollo.
Métodos
Silenciamiento de shRNA de ITGB8
Se compraron partículas lentivirales que contenían shRNA hasta la quietud ITGB8 y shRNA de control (mixto) de Santa Cruz (Alemania). Las condiciones de transducción se mejoraron utilizando partículas lentivirales Cop-GFP. Las hMSC se sembraron en placas de 12 pocillos a 6000 células/cm2 y se desarrollaron hasta la mitad de la confluencia. Se transdujeron con 10 μl/ml de infección en 5 μg/ml de polibreno en medio de desarrollo. Después de 24 h, se cambió el medio y se permitió que las células se recuperaran durante 24 h más. Luego se cambiaron a medio de elección, que contenía 4 μg/ml de puromicina. Después de tres días, las célulasse agruparon, probaron la productividad de la transducción y se refinaron en condiciones de desarrollo estándar hasta las pruebas de separación. La separación se realizó en el modelo de micromasa y la evaluación del registro ocurrió después de 0, 4, 7 y 21 días.
Mancha occidental de integrina β8
Las hMSC se lavaron en PBS y se lisaron en una cuna RIPA (Sigma, Reino Unido) mejorada con proteasa(Roche, Reino Unido) e inhibidores de la fosfatasa (Sigma, Reino Unido). El lisado se explicó por centrifugación a 4 ° C y la proteína completa se evaluó con un examen de Bradford (Sigma, Reino Unido). Se apilaron 15 μg de proteína completa en tampón de muestra de Laemmli en un gel SDS-PAGE al 10 %. La proteína se movió a una película de PVDF en condiciones de intercambio húmedo. La película se impidió con BSA al 5 % (p/v) en TBS/T y se incubaron en anticuerpos contra la integrina β8 (1/200; sc-6638, Santa Cruz, Alemania) y GAPDH (1/5000; Clon 2D4A7, Thermo Fisher , Reino Unido) a corto plazo a 4 °C. Después del lavado, la película se incubaba en anticuerpos opcionales contra IgG (hostil para cabra 1/5000 y hostil para ratón 1/5000; Li-Cor Biosciences, Reino Unido) nombrado con IRDye. La mancha se imaginó en una Odyssey CLx con programación Image Studio (Li-Cor Biosciences, Reino Unido).
Discusión
ITGB8 fue una de las principales subunidades de integrina controlada de manera confiable en todos los modelos de condrogénesis en esta investigación. Dado su conocido trabajo en la llegada mecánica y proteolítica de TGF-β desde su complejo de inactividad, intentamos mostrar su trabajo en la condrogénesis. Una caída del ARNm del 89 % provocó una articulación no discernible de COL2A1, el marcador característico del ligamento hialino, lo que muestra la importancia de esta integrina en la separación condrogénica de las hMSC. También provocó una elevación de los marcadores de red pericelular COL6A1 y HSPG2, y en los dos casos, esta expansión fue más articulada en medio de desarrollo que en medio condrogénico. Aún no está claro cómo esta caída de la integrina β8 está influyendo en la señalización de TGF-β, pero podría tener que ver con la fuente de TGF-β. Hay algunas pruebas de que, si bien TGF-β3 tiene un resultado constructivo, la señalización de TGF-β1 puede sofocar la separación condrogénica. La eliminación de la integrina αvβ8 habría disminuido la capacidad de la célula para iniciar el TGF-β insoluble (emitido por la célula), pero no se habría entrometido fundamentalmente con su tipo oficial de factor de desarrollo solvente (mediano mejorado, TGF-β3). En cualquier caso, esto podría aclarar de manera incompleta por qué los impactos de la caída de la integrina β8 en el fenotipo celular fueron influenciados por la pieza del medio. El trabajo futuro podría incorporar la descripción del impacto de las isoformas de TGF-β en el movimiento intervenido por la integrina αvβ8 en la separación condrogénica. La eliminación de la integrina αvβ8 habría disminuido la capacidad de la célula para iniciar el TGF-β insoluble (emitido por la célula), pero no se habría entrometido fundamentalmente con su tipo oficial de factor de desarrollo solvente (mediano mejorado, TGF-β3). En cualquier caso, esto podría aclarar de manera incompleta por qué los impactos de la caída de la integrina β8 en el fenotipo celular fueron influenciados por la pieza del medio. El trabajo futuro podría incorporar la descripción del impacto de las isoformas de TGF-β en el movimiento intervenido por la integrina αvβ8 en la separación condrogénica. La eliminación de la integrina αvβ8 habría disminuido la capacidad de la célula para iniciar el TGF-β insoluble (emitido por la célula), pero no se habría entrometido fundamentalmente con su tipo oficial de factor de desarrollo solvente (mediano mejorado, TGF-β3). En cualquier caso, esto podría aclarar de manera incompleta por qué los impactos de la caída de la integrina β8 en el fenotipo celular fueron influenciados por la pieza del medio. El trabajo futuro podría incorporar la descripción del impacto de las isoformas de TGF-β en el movimiento intervenido por la integrina αvβ8 en la separación condrogénica.
Varias investigaciones han demostrado que la consolidación de ligandos de integrina en una plataforma puede afectar la conducta celular. Por ejemplo, se ha demostrado que IKVAV, un ligando de integrina determinado por laminina, ayuda a la razonabilidad de hMSC. En nuestros exámenes, encontramos que ITGA3 e ITGA6, que se sabe que se heterodimerizan con ITGB1 (junto con ITGB4 a causa de ITGA6) para unir laminina, comúnmente estaban dirigidos hacia abajo en la separación condrogénica. Esto concuerda con el hallazgo de que las hMSC pueden verse reforzadas por IKVAV, pero sugiere que los condrocitos no lo harán. Como modelo posterior, cuando GFOGER, un péptido mimético del colágeno equipado para restringir las célulaspor medio de integrinas β1 se unió en hidrogeles de poli(etilenglicol) (PEG), las hMSC experimentaron una separación condrogénica en un grado más notable que en los hidrogeles solos. Esto también coincide con nuestros resultados, que encontraron una articulación moderadamente consistente de las integrinas que restringen el colágeno, lo que sugiere que tanto las hMSC como los condrocitos reaccionarían bien al colágeno extracelular. Finalmente, la fibronectina y sus derivados peptídicos a menudo se usan para mejorar la unión celular estable, pero algunos estudios muestran un impacto negativo en la condrogénesis cuando RGD se une en estructuras. En este estudio, descubrimos que una parte de las integrinas restrictivas de la fibronectina (específicamente, ITGAV) mantuvo una articulación moderadamente constante durante la condrogénesis. La proximidad de estos receptores muestra que tanto las hMSC como los condrocitos pueden mantener su fenotipo frente a la fibronectina. Esto es razonable, ya que la fibronectina está disponible en la ECM durante la separación y en los condrocitos en crecimiento. Sería especialmente digno de mención tener en cuenta el cambio transitorio de la articulación de la integrina para dirigir la articulación fundamental.microorganismos para convertirse en condrocitos. Los ligandos de integrina, que obligan a la articulación de integrina que cambia transitoriamente determinada en este estudio, podrían consolidarse en marcos de diseño de tejidos para influir en la conducta celular. Este concepto se ha intentado en la adipogénesis y la osteogénesis, pero los intentos de centrarse en las integrinas específicas en la condrogénesis hasta ahora se han centrado básicamente en prevenir la desdiferenciación de los condrocitos en desarrollo.
Conclusión
En conclusión, hemos completado una caracterización de la expresión de integrinas en tres modelos de condrogénesis in vitro.
Encontramos que la articulación de la integrina en general disminuyó en la separación condrogénica y que el flujo de salida de la mayoría de las subunidades se dirigió transitoriamente. Analizamos más a fondo el trabajo de la integrina β8 y descubrimos que su eliminación provocó un aumento de la unión del marco pericelular y el final de la articulación COL2A1. Habiendo considerado la articulación de la integrina en varios modelos de condrogénesis y mostrando un trabajo para la integrina β8 en la condrogénesis, este estudio ha mejorado nuestra comprensión de la articulación de la integrina en la separación condrogénica y el trabajo de la MEC en la conducta celular impactante. Puede iluminar la estructura futura con respecto a las plataformas de diseño de tejidos para incorporar ligandos para tener en cuenta las necesidades cambiantes de agarre de las hMSC en la separación condrogénica.