Revista de glucómica y lipidómica
Acceso abierto

abstracto

High-Throughput Screening of Lipidomic Adaptations in Cultured Cells

Aiken Jecuken

La detección de alto rendimiento de sustancias biológicamente activas en cultivos celulares sigue siendo un desafío a pesar del gran progreso en las técnicas lipidómicas contemporáneas. Estos experimentos generan grandes cantidades de datos que se traducen en huellas dactilares de lípidos. La visualización posterior de los cambios lipidómicos es clave para una interpretación significativa de los resultados experimentales. Como demostración de una vía rápida y versátil para el análisis lipidómico, cultivamos células HeLaen formato de 96 pocillos durante cuatro días en presencia o ausencia de varios inhibidores de las vías metabólicas de los lípidos. La visualización de los datos mediante el análisis de componentes principales reveló una alta reproducibilidad del método, así como cambios específicos del fármaco en el lipidoma. La construcción de mapas de calor y redes reveló las similitudes y diferencias entre los efectos de diferentes fármacos a nivel de especies de lípidos . Grupos de especies de lípidos relacionados que podrían representar distintos dominios de membrana surgieron después del análisis de correlación del conjunto de datos completo. En conjunto, presentamos una plataforma lipidómica para el análisis lipidómico de alto rendimiento de líneas celulares cultivadas. La lipidómica de alto rendimiento tiene un gran potencial cuando se investiga el papel de los lípidos en el metabolismo celular. Una gran cantidad de drogasestá disponible para interferir con las vías metabólicas normales de los lípidos y las técnicas lipidómicas contemporáneas pueden monitorear los niveles de cientos de lípidos simultáneamente. Sin embargo, la verdadera lipidómica de alto rendimiento aún implica la superación posterior de varios desafíos. En primer lugar, la limpieza de las muestras para poder medir su composición lipídica. Los protocolos establecidos para la extracción de lípidos involucran extracciones líquido-líquido después de un sistema inicial de una fase. En este sistema de una fase, los lípidos y los metabolitos hidrofílicos permanecen disueltos, mientras que las proteínas precipitan y se eliminan por centrifugación. La posterior inducción de un sistema de dos fases mediante la adición de agua y/o disolvente orgánico, separa los metabolitos hidrofílicos e hidrofóbicos. Junto con pasos de lavado adicionales para aumentar la recuperación de lípidos, el proceso de extracción en dos fases es laborioso, lento y engorroso de automatizar. A continuación, se debe elegir entre la lipidómica de escopeta o una cromatografía líquida de masas.enfoque de espectrometría (LC-MS ⁿ ). La lipidómica de escopeta, es decir, la infusión directa del extracto de lípidos, se basa únicamente en técnicas de espectrometría de masas para la toma de huellas dactilares de lípidos. Los enfoques LC-MS ^{n se basan en} cromatografía  líquida de fase inversa (RP), fase normal (NP) o de interacción hidrófila(HILIC) han demostrado su valor ya que agregan tiempo de retención como una característica adicional que puede ayudar en la identificación de lípidos específicos. En particular, la separación de clases de lípidos basada en HILIC permite el análisis lipidómico basado en LCMS en lapsos de tiempo que normalmente solo se pueden lograr mediante lipidómica de escopeta. Aquí, utilizamos una técnica HILIC-LCMS tan rápida para obtener la máxima sensibilidad y especificidad, al tiempo que evitamos la supresión de iones comúnmente asociada con la lipidómica de escopeta. Para la traducción de datos de LC-MS a una lista de picos (semi)cuantitativa y anotada, se han demostrado con éxito varias estrategias para instrumentos de alta y baja resolución. Por lo general, un experimento de lipidómica da como resultado la identificación de varios cientos de especies de lípidos. La interpretación de los resultados obtenidos es más desafiante que en otros campos de la -ómica.experimentos proteómicos y genómicos, las proteínas cambiantes pueden estar directamente vinculadas a vías enzimáticas o de señalización, lo que brinda pistas claras sobre funciones celulares alteradas. También en la metabolómica (hidrofílica), la mayoría de los metabolitos son el producto de una o muy pocas enzimas, y son un sustrato para muy pocas otras enzimas. Por lo tanto, también en metabolómica, los niveles alterados de metabolitos pueden asignarse directamente a cambios en las vías metabólicas. En lipidómica, este mapeo es más desafiante, pero la bioinformáticase han convertido en una parte integral de la tubería lipidómica. Los datos lipidómicos contienen una capa adicional de detalle. Mientras que los mapas metabólicos bidimensionales (2D) normalmente presentan una clase de lípidos como la fosfatidilcolina (PC) o la fosfatidiletanolamina (PE) como un solo metabolito, la subclase de lípidos y la composición de acilo agregan una tercera dimensión al mapa. Las funciones de los lípidos pueden depender de esta capa adicional, por ejemplo, las fosfolipasas pueden actuar solo en un subconjunto de especies de lípidos dentro de una clase de lípidos y la aparición de microdominios de lípidos también está regulada en las especies de lípidos.nivel. La interpretación de los datos lipidómicos, por lo tanto, es particularmente desafiante. Asimismo, es probable que la interferencia con el metabolismo de los lípidos, ya sea inducida por fármacos o como resultado de una patología, afecte a muchas especies de lípidos. Es imposible discriminar entre los efectos primarios clave y los efectos secundarios menos relevantes sin considerar el (fosfo-)lipidoma completo y comprender las interacciones existentes entre las especies de lípidos. Por lo tanto, las visualizaciones ricas en información de los cambios en el lipidoma complejo son importantes. Una vez que esto se logra, se pueden comparar múltiples fármacos o condiciones celulares. Aquí comparamos los efectos de nueve fármacos diferentes en el lipidoma celular de la línea celular HeLa. Elegimos las drogasque se utilizan ampliamente en la literatura, están fácilmente disponibles y se dirigen a una variedad de procesos celulares. Estos experimentos se realizaron con un enfoque de alto rendimiento, que permite a un científico completar todo el análisis lipidómico, desde la extracción de lípidos y la LC-MS hasta las visualizaciones, en un solo día. De esta forma, pudimos demostrar una alta reproducibilidad de los cambios lipidómicos en nuestros experimentos. Además, visualizamos similitudes y diferencias entre fármacos y sus efectos sobre las especies lipídicas. Nuestro uso de inhibidores que interfieren en diferentes puntos del metabolismo de los lípidos nos permitió investigar qué especies de lípidosse correlacionan fuertemente entre sí, ya sea positiva o negativamente. En conjunto, demostramos cómo se puede implementar la lipidómica en pantallas de alto contenido ómico.