Revista de Síndromes Genéticos y Terapia Génica
Acceso abierto

abstracto

Transferencia de genes ex vivo de alta eficiencia a células B murinas primarias utilizando vectores plasmídicos o virales

Babak Moghimi, Irene Zolotukhin, Brandon K. Sack, Roland W Herzog y Ou Cao

Los linfocitos B autólogos primarios, luego de la transferencia y reimplantación de genes ex vivo, se han utilizado con éxito para prevenir enfermedades autoinmunes y respuestas adaptativas a Proteínas terapéuticas en varios modelos animales. Sin embargo, la transferencia génica eficiente a las células B primarias requiere el uso de vectores retrovirales, lo que aumenta el riesgo de mutagénesis por inserción. Aquí, evaluamos varios enfoques alternativos de transferencia de genes. Las células B esplénicas en reposo se purificaron y activaron con LPS, y la transferencia del gen GFP ex vivo se realizó por medio de nucleofección, lipofectamina, infección adenoviral o infección retroviral murina. Los vectores adenovirales (Ad) se añadieron a cultivos de células B con o sin precipitación con fosfato de calcio. Para la transfección y la nucleofección, se utilizó ADN de plásmido desnudo. La tecnología de nucleofección representa una técnica de electroporación modificada para la transferencia efectiva de ácidos nucleicos al núcleo y, por lo tanto, mejora la eficiencia de la transferencia, particularmente para las células primarias. La eficiencia de la transferencia génica ex vivo se determinó mediante citometría de flujo usando GFP, CD19 y un colorante vital como marcadores. La nucleofección produjo el nivel más alto de transferencia génica con un 60-65 % de células B que eran GFP+. Las eficiencias fueron del 30-35 % para retrovirus, 20 % para Ad5/11, 15 % para Ad5/35 y 5 % para la transfección mediada por lipofectamina. La precipitación con fosfato de calcio aumentó la eficiencia de los vectores Ad al 30 % (Ad5/11) y al 25 % (Ad5/35). La lipofectamina causó la mayor muerte celular con un 80 %, seguida de la nucleofección (35 %) y el vector viral (10-15 % en cada caso). Para todos los métodos, las eficiencias de transferencia de genes fueron casi idénticas para las células B de ratones C57BL/6 o C3H/HeOuJ. En conclusión, los avances recientes en las tecnologías de transferencia de genes proporcionan alternativas a los vectores retrovirales para las células B primarias. Si se desea una transferencia de genes estable, los sistemas de vectores que no se integran pueden combinarse con sistemas basados en transposones o integrasas de fagos o futuros sistemas específicos de sitio para lograr la integración en el genoma de la célula B huésped.