Clonación y transgénesis
Acceso abierto

abstracto

Expresión heteróloga y purificación de una proteína de superficie asociada a biopelícula grande (Bap) de 238 kDa en Escherichia coli

Sudhir K. Shukla y T. Subba Rao

La proteína asociada a biopelícula (Bap) es una proteína de superficie grande (~238 kDa) que juega un papel importante en el desarrollo de biopelículas de Staphylococcus. Las proteínas de superficie en S. aureus son funcionalmente redundantes, lo que implica que un mutante nulo que afecta a una proteína de superficie podría ser solo parcialmente defectuoso en la función estudiada. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue clonar, sobreexpresar y purificar la proteína Bap completa en E. coli para permitirnos caracterizar la proteína en detalle para futuros experimentos. La parte desafiante de este estudio fue resolver el problema de la inestabilidad del plásmido de la construcción recombinante, que se especula que se debe al gran tamaño del gen y la presencia de 13 repeticiones directas en tándem, cuando las cepas convencionales de E. coli como DH5-&alpha ; y XL1-Blue se usaron como huésped de clonación y se optimizaron los parámetros para la sobreexpresión del gen. El gen bap completo (~6,8 kb) se amplificó mediante polimerasa Taq de largo alcance y se clonó en un vector de expresión pET21b en E. coli stbl2 y en BL21(DE3)-pLysS para la sobreexpresión. La secuenciación del ADN del gen clonado confirma el 100 % de identidad con el gen bap in situ (S. aureus V329). La expresión exitosa de la proteína Bap de longitud completa en E. coli BL21(DE3)-pLysS fue confirmada por SDS-PAGE y transferencia Western utilizando anticuerpos anti-His tag. Hasta donde sabemos, es el primer intento de clonar y sobreexpresar la proteína Bap de longitud completa en E. coli. El uso del gen Bap recombinante nos permitirá estudiar y ayudar en su caracterización biofísica.