Revista de glucómica y lipidómica
Acceso abierto

abstracto

GemSpot allows modeling of ligands in cryo-EM maps

Arunima Singh

Los desarrollos recientes en microscopía crioelectrónica (crio-EM) ahora permiten de forma rutinaria una resolución casi atómica y de nivel atómico para biomoléculas. Sin embargo, determinar las estructuras de los complejos proteína-ligando sigue siendo un desafío, ya que la resolución del ligando unido es significativamente menor que la de la proteína. Por lo tanto, comprender la posición de unión del ligando requiere soluciones creativas, como el uso de métodos de química computacional junto con datos experimentales. Robertson et al. han desarrollado GemSpot, una tubería de acoplamiento computacional automatizada para modelar y evaluar poses de unión de ligandos en mapas crio-EM. Utiliza la herramienta GlideEM para realizar el acoplamiento, teniendo en cuenta los potenciales del mapa EM como restricciones. El refinamiento del modelo se realiza utilizando el campo de fuerza OPLS3e y los cálculos de la mecánica cuántica, y los sitios de las moléculas de agua se predicen utilizando JAWS. Los autores demuestran la tubería en varias proteínas en diferentes niveles de complejidad de modelado y resolución de mapas EM. La criomicroscopía electrónica (cryoEM) ha surgido como una metodología importante para la determinación de estructuras de alta resolución deMacromoléculas y sus complejos. El número de estructuras cryoEM depositadas en el PDB 1  con una resolución superior a 4 Å ha aumentado de 48 en 2015 a casi 1500 hasta la fecha. Estas estructuras incluyen muchos complejos macromoleculares y proteínas de membrana que, en general, han demostrado ser muy desafiantes o intratables para las técnicas estructurales tradicionales, en particular la cristalografía de rayos X. Por ejemplo, los GPCR y los canales iónicos son clases muy importantes de objetivos farmacológicos que representan el 33 % y el 18 % de los productos farmacéuticos aprobados por la FDA respectivamente, donde los estudios estructurales han estado históricamente limitados por las dificultades asociadas con su cristalización, aunque se han realizado avances recientes. CryoEM, por otro lado, ofrece flujos de trabajo cada vez más robustos para la determinación estructural de este tipo de macromoléculas 4 . Como resultado, cryoEM está abriendo oportunidades sin precedentes para el descubrimiento de fármacos basados ​​en estructuras en una gran variedad de objetivos que hasta hace poco eran intratables. El descubrimiento de fármacos basado en la estructura es un enfoque de diseño racional de fármacos que tiene en cuenta la estructura tridimensional del objetivo biomolecular 5 . La estructura sin ligando se puede emplear para la detección virtual a gran escala para obtener compuestos de éxito inicial con la actividad bioquímica deseada .Con los compuestos principales en la mano, es necesaria una estructura experimental del complejo ligando para verificar el modo de unión exacto y, a menudo, ayuda a identificar modificaciones para mejorar la potencia. La pose correcta es particularmente importante para métodos como los cálculos de perturbación de energía libre, donde un compuesto se muta alquímicamente a un análogo en el transcurso de una simulación molecular y se calcula la energía libre relativa de unión, como se demostró recientemente con éxito en un derivado cryoEM. estructura para ATP-citrato liasa humana Además, una estructura de resolución suficientemente alta (generalmente <2,5 Å) permitirá la identificación de moléculas de agua unidas, que pueden desempeñar un papel crucial en el diseño de fármacos . Por ejemplo, el desarrollo exitoso de VIH Los inhibidores de la proteasa a menudo implican el reemplazo de un agua estructural clave . Dado el notable progreso reciente de cryoEM, la metodología se convertirá en una herramienta invaluable para los esfuerzos de descubrimiento de fármacos , especialmente para desafiar los complejos macromoleculares. Destacado por los continuos avances en la preparación de muestras , la recopilación automatizada de datos y la disponibilidad mejorada de microscopios capaces de lograr una alta resolución, cryoEM inevitablemente se empleará en la fase de optimización principal para obtener estructuras de compuestos intermedios unidos a sus objetivos. Décadas de cristalografía han llevado a métodos robustos de modelado y validación de estructuras cristalinas de proteína-ligando .Si bien tanto la cristalografía de rayos X como la crioEM de una sola partícula son, en principio, técnicas de dispersión basadas en la interacción de la radiación con una muestra biológica, existen diferencias clave que complican el modelado en los mapas de crioEM e impiden el uso de las métricas desarrolladas para las estructuras cristalinas. En cristalografía, la información de fase de la radiación dispersada que se mide se pierde y debe recuperarse con información experimental adicional (p. ej., dispersión anómala de múltiples longitudes de onda (MAD), desplazamiento isomorfo) o comparación con estructuras conocidas (reemplazo molecular )Luego, los valores de la fase inicial se mejoran durante la construcción del modelo al comparar la dispersión calculada del modelo actual con la dispersión experimental. Por lo tanto, la determinación de la estructura de la cristalografía de rayos X implica una conversación cruzada continua entre el modelo y los datos experimentales con retroalimentación simultánea sobre la calidad del modelo. Por el contrario, en cryoEM las fases están fácilmente disponibles ya que están integradas en las imágenes de la muestra, que se utilizan directamente para el cálculo de mapas 3D. Una vez que se ha determinado un mapa tridimensional final a partir de miles de proyecciones experimentales, el modelo se integra en el mapa sin más comentarios de los datos EM sin procesar. Además, los mapas obtenidos en cristalografía corresponden a la densidad electrónica, mientras que en cryoEM representan el potencial coulombiano de la molécula bajo investigación. De este modo, el uso directo de las herramientas desarrolladas para la cristalografía para el modelado de estructuras cryoEM puede ser inherentemente problemático. Si bien el número de mapas crioEM de complejos macromoleculares determinados hasta la fecha es relativamente bajo, las estructuras existentes sugieren que existen algunos desafíos fundamentales asociados con el modelado de complejos proteína-ligando. Incluso con datos de muy alta resolución para una biomolécula, la resolución del mapa para un ligando unido suele ser significativamente menor que su entorno circundante.14 . Dado que las estructuras cryoEM derivan de macromoléculas ultracongeladasen solución acuosa, quizás no sea sorprendente observar movilidad adicional para algunos ligandos dentro de los sitios activos de proteínas. Además, las reconstrucciones cryoEM son vulnerables a características de mapas espurios, actualmente evidentes con diferentes software que producen mapas notablemente diferentes del mismo conjunto de datos. Esta característica puede deberse a imprecisiones en la estimación del desenfoque de la imagen y la corrección de la función de transferencia de contraste a alta resolución, así como a la variabilidad en los esquemas de enmascaramiento y ponderación empleados en diferentes plataformas de software para procesar datos cryoEM. En particular, en algunos casos, incluso diferentes configuraciones con el mismo software producirán desviaciones de mapas que pueden tener efectos significativos en el modelado de ligandos. Este problema se ve agravado por el hecho de que los ligandos carecen de las restricciones estructurales adoptadas por las proteínas, por ejemplo, Restricciones de estructura secundaria que facilitan un modelado más robusto. Tales advertencias presentan al modelador el desafío de identificar la pose unida de un ligando dentro de un mapa cryoEM de resolución relativamente alta, lo que resulta en poses e interpretaciones de ligando a menudo incorrectas con implicaciones significativas para el mecanismo molecular yesfuerzos de descubrimiento de fármacos . Paralelamente a los desarrollos en cryoEM, los métodos de química computacional para modelar complejos proteína-ligando han mejorado significativamente con el tiempo. Los campos de fuerza computacional se han utilizado con éxito durante décadas para describir la energía y las fuerzas de diversas conformaciones de proteínas 15 . Estos campos de fuerza se han ampliado para describir con precisión la energía y la fuerza de una gran variedad de ligandos, y los usuarios pueden expandirlos fácilmente para cubrir ligandos de interés o incluso extenderse automáticamente para cubrir ligandos fuera de los utilizados en la parametrización inicial . Dichos parámetros de campo de fuerza se han utilizado para una variedad de aplicaciones, incluida la dinámica. y para enumerar las conformaciones de proteínas y ligandos que serán accesibles en condiciones biológicamente relevantes . El acoplamiento molecular es un enfoque que utiliza campos de fuerza, junto con algoritmos de muestreo y refinamiento altamente optimizados, para predecir los modos de unión proteína-ligando dada solo la conformación de la proteína y la identidad del ligando . Esta metodología se ha aplicado ampliamente tanto para identificar ligandos que se unen a proteínas específicas con alta afinidad como para predecir sus conformaciones de unión proteína-ligando. Sin embargo, cabe señalar que, en ausencia de datos experimentales, estos métodos puramente computacionales a menudo se ven obstaculizados por tasas significativas de falsos positivos y falsos negativos. Para el diseño de fármacos basado en la estructura, también se ha puesto un énfasis significativo en la predicción de la ubicación de las moléculas de agua, que a menudo coordinan la unión del ligando en los bolsillos y tienen efectos profundos en las actividades farmacológicas. Varios enfoques para predecir los sitios de hidratación, incluidos enfoques basados ​​en cuadrículas como JAWS y enfoques dinámicos como WATERMAP ahora son capaces de predecir la ubicación de las moléculas de agua unidas. Estas predicciones computacionales producen una concordancia impresionante con estructuras derivadas experimentalmente y resaltan aún más el papel de la hidratación en la optimización de plomo. Por lo tanto, se hace evidente que se puede emplear una variedad de herramientas computacionales bien establecidas en combinación con cryoEM para abordar el desafío de modelar ligandos en mapas cryoEM. . Con este fin, hemos desarrollado y validado 'GemSpot', una tubería de métodos de química computacional que ayuda a obtener la pose de unión más probable usando una combinación de acoplamiento de ligando junto con refinamiento, cálculos mecánicos cuánticos (QM), colocación automática de agua y más información externa, todo ello teniendo en cuenta los datos crioEM experimentales.péptidos (Esquema de todos los ligandos en Suplementación. En el primer paso usando GemSpot, el ligando se acopla con el popular software GLIDE mediante el empleo de una combinación novedosa de la función de puntuación de acoplamiento GLIDE tradicional y una puntuación de correlación cruzada espacial real al mapa. Este software , llamado GlideEM, genera varias poses candidatas para el ligando que luego se someten a un refinamiento espacial real con PHENIX incluido el campo de fuerza OPLS3e / VSGB2.1 de última generación. Se utiliza una combinación de coeficiente de correlación de espacio real y puntajes de acoplamiento de refinamiento previo para eliminar cualquier pose que tenga poco sentido químico o encaje mal en el mapa experimental. Una vez que se identifican las mejores poses, se pueden utilizar más técnicas computacionales para generar una mayor confianza en la pose candidata principal, cuando sea necesario. Para los mapas EM de alta resolución, se puede usar un enfoque de energía libre para hidratar el sitio activo usando JAWS para ayudar a diferenciar las moléculas de agua potenciales del ruido en el mapa y obtener información sobre las interacciones de los ligandos. Cuando todavía hay dudas sobre la conformación de la molécula, se puede aprovechar la química cuántica para examinar la tensión conformacional asociada con cualquier pose unida, por ejemplo, con GAUSSIAN o Jaguar. En situaciones en las que estos métodos computacionales por sí solos no puedan determinar una sola pose que se ajuste sin ambigüedades a todos los datos, puede ser necesario determinar cuáles de las mejores poses también son consistentes con los datos de otros experimentos. Particularmente valiosa es la comparación con los datos de la relación estructura-actividad (SAR), es decir, si la pose prospectiva puede explicar efectivamente los cambios en la afinidad de unión por los análogos de esa molécula. Al combinar los datos resultantes, a menudo se puede obtener un alto grado de confianza incluso con una resolución baja o una densidad problemática para el ligando. Particularmente valiosa es la comparación con los datos de la relación estructura-actividad (SAR), es decir, si la pose prospectiva puede explicar efectivamente los cambios en la afinidad de unión por los análogos de esa molécula. Al combinar los datos resultantes, a menudo se puede obtener un alto grado de confianza incluso con una resolución baja o una densidad problemática para el ligando. Particularmente valiosa es la comparación con los datos de la relación estructura-actividad (SAR), es decir, si la pose prospectiva puede explicar efectivamente los cambios en la afinidad de unión por los análogos de esa molécula. Al combinar los datos resultantes, a menudo se puede obtener un alto grado de confianza incluso con una resolución baja o una densidad problemática para el ligando.