Investigación inmunológica
Acceso abierto

abstracto

Moléculas MHC clase II recombinantes funcionales y ensayos de unión de péptidos de alto rendimiento

Sune Justesen, Mikkel Harndahl, Kasper Lamberth, Lise-Lotte B Nielsen

Antecedentes: las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad de clase II (MHC-II) se unen específicamente y presentan epítopos peptídicos derivados de forma exógena a las células auxiliares T CD4+. El polimorfismo extremo del MHC-II dificulta el análisis completo de la unión de péptidos. También es un obstáculo importante en la generación de moléculas MHC-II como reactivos para estudiar y manipular respuestas específicas de células T colaboradoras. Serían muy deseables métodos para generar moléculas MHC-II funcionales de forma recombinante y medir su interacción con péptidos; sin embargo, aún no ha surgido una metodología de consenso. Resultados: Generamos α y β Construcciones de cadenas de MHC-II, en las que las regiones que se extienden por la membrana se reemplazaron por motivos de dimerización, y el C-terminal de la eta; cadenas se fusionó con un péptido señal de biotinilación (BSP) que permite la biotinilación in vivo. Estas cadenas se produjeron por separado como cuerpos de inclusión en E. coli, se extrajeron en urea y se purificaron en condiciones desnaturalizantes y no reductoras usando cromatografía en columna convencional. Posteriormente, la dilución de las dos cadenas en una reacción de plegamiento con el péptido apropiado dio como resultado la formación eficiente del complejo péptido-MHC-II. Se desarrollaron varios formatos diferentes de ensayo de unión de péptidos, incluido un ensayo de unión homogéneo, no radiactivo y de alto rendimiento (HTS). Se generaron isotermas de unión que permitieron determinar las afinidades de interacción. Se encontró que las afinidades de los mejores aglutinantes estaban en el rango nanomolar bajo. Se desarrollaron con éxito moléculas MHC-II recombinantes y el ensayo de unión de péptidos HTS acompañantes para nueve moléculas MHC-II diferentes, incluidas DPA1*0103/DPB1*0401 (DP401) y DQA1*0501/DQB1*0201, donde tanto α y β las cadenas son polimórficas, lo que ilustra las ventajas de producir las dos cadenas por separado. Conclusión: Hemos desarrollado con éxito recursos versátiles de MHC-II, que pueden ayudar en la generación de reactivos, datos y herramientas para todo el MHC de clase II.