Revista de métodos de diagnóstico médico
Acceso abierto

abstracto

Evaluación de métodos de laboratorio clínico para análisis de ADN libre de células plasmáticas en sospecha de septicemia

Urosevic N, Inglis TJJ, Grasko J y Lim EM

Antecedentes: La cantidad y calidad del ADN libre de células plasmáticas (cfDNA) cambia en condiciones fisiológicas y patológicas extremas. Estos cambios podrían proporcionar una base para un nuevo biomarcador de pronóstico en condiciones tan diversas como el embarazo, el cáncer, el trasplante de órganos y la septicemia. Se necesita la evaluación de los métodos actuales para el análisis de cfDNA para identificar el mejor enfoque práctico para el diagnóstico médico.

Métodos: Inicialmente, se extrajo ADN de cf del plasma de nueve pacientes con enfermedad febril utilizando los kits QIAamp Circulating Nucleic Acid y QI Aamp Mini Blood DNA. La concentración de cfDNA se determinó mediante qPCR de β-globina usando mezclas PerfeCta y AmpliTaq. Posteriormente, se utilizaron ensayos fluorimétricos y de gel en un chip de Qubit para analizar el ADN sin células en plasma de 64 pacientes adicionales con sospecha de septicemia y hemocultivos positivos.

Resultados: la determinación de la concentración de CfDNA mediante la qPCR del gen de la β-globina utilizando la mezcla AmpliTaq fue superior a la de la qPCR PerfeCta. Además, a diferencia de PerfeCta AmpliTaq qPCR determinó números de copias equivalentes del genoma similares en cfDNA aislado mediante cualquiera de los métodos de extracción de ADN. El kit QIAamp Mini Blood y AmpliTaq qPCR se utilizaron posteriormente en un estudio prospectivo más amplio para la solación y cuantificación de cfDNA, respectivamente. Sin embargo, la qPCR fue menos adecuada para la detección de niveles altos de cfDNA en plasma en comparación con la medición directa de ADN por Qubit (media de 22,23 ng/ml frente a 61,38 ng/ml, respectivamente) a pesar de la buena correlación entre los dos métodos. A continuación, se utilizó el método del chip de microfluidos de ADN para determinar los tamaños de los fragmentos de cfDNA y sus concentraciones relativas, lo que reveló la presencia de fragmentos de ADN del tamaño de un nucleosoma que presentaban una fuerte correlación positiva con el cfDNA total. Además, el ADN apoptótico se identificó como un componente principal del ADN en el plasma con un alto contenido de cfDNA.

Conclusiones: la qPCR de β-globina es más adecuada para la detección de concentraciones plasmáticas bajas de cfDNA, mientras que el ensayo Qubit es una mejor opción para la identificación rápida de concentraciones plasmáticas altas. La apoptosis es una fuente importante de cfDNA en plasma con altas concentraciones de cfDNA según el análisis de chips de ADN.