Sistema reproductivo y trastornos sexuales: investigación actual
Acceso abierto
ISSN: 2161-038X
ISSN: 2161-038X
Ewa L. Gregoraszczuk
Abstracto
Un hallazgo típico en las células de crecimiento del cáncer es la sobreexpresión de histonas desacetilasas (HDAC), lo que provoca una articulación y movimiento ajustados de varias proteínas asociadas con la carcinogénesis. Teniendo en cuenta que la leptina puede regular los niveles de HDAC, teorizamos que los enemigos de los receptores de leptina pueden cambiar la articulación de HDAC.
Materiales y métodos : se evaluó la articulación HDAC en células presentadas a leptina y enemigos del receptor de leptina (SHLA y Lan2) en células epiteliales y de foliculoma ovárico (COV434, KGN).
Resultados : Se encontró una mayor articulación de HDAC en células epiteliales en contraste con células de foliculoma. La leptina expandió las HDAC de clase I y II solo en las células OVCAR-3, y SHLA fue cada vez más fuerte que Lan-2. En las células de foliculoma, la leptina simplemente expandió la articulación HDAC de clase II; Lan-2 fue más intenso que SHLA en el COV434 y ninguno de los antagonistas influyó en las células KGN.
Conclusión : SHLA y Lan2 eliminan los impactos negativos de la leptina en la articulación HDAC de forma subordinada al tipo celular. Este es el informe principal que prueba los bloqueadores de los receptores de leptina como inhibidores de HDAC en células de cáncer de ovario .
Palabras clave: cáncer de ovario, leptina, bloqueador de los receptores de leptina, expresión de HDAC
Introducción: Los cambios epigenéticos, por ejemplo, las alteraciones postraduccionales de las histonas pueden asumir un papel importante en el cánceravance. Dos grupos de productos químicos son responsables del ejemplo de acetilación de las histonas: las histonas acetilasas (HAT) y las histonas desacetilasas (HDAC). La importancia de los HDAC sobre los HAT provocó la restricción de la lista de algunas cualidades responsables de la ocultación de la carcinogénesis. Además, las HDAC también son responsables de la desacetilación de proteínas no histonas que dirigen el movimiento del ciclo celular, la multiplicación y la apoptosis. Los HDAC de mamíferos se dividen en cuatro clases. Los HDAC 1, 2, 3 y 8 establecen la clase I. Los HDAC 4-7, 9 y 10 estructuran la clase II. Los HDAC de clase III son catalizadores subordinados a NAD+, también llamados sirtuinas (SIRT). HDAC11, el principal individuo de HDAC Clase IV, consolida los aspectos más destacados de la clase I y II.
Un hallazgo típico en las células de crecimiento canceroso es la sobreexpresión de HDAC y su movimiento expandido, lo que provoca la articulación y acción modificadas de varias proteínas asociadas con la carcinogénesis. A pesar de que la información sobre la enfermedad ovárica está en desarrollo, todavía no existe un tratamiento adecuado para contrarrestar y tratar este tipo de crecimiento maligno. Hay un grupo de pruebas en desarrollo que indica que la salida de HDAC de clase I se expande en los carcinomas de ovario y esto se relaciona no solo con asumir un papel importante en la carcinogénesis, sino también con contribuir a la protección contra los operadores quimioterapéuticos utilizados para recompensar el crecimiento maligno de ovario. . Jin et al. demostró que los HDAC
de la clase I se sobreexpresan en las pruebas de enfermedades ováricas en comparación con las pruebas obtenidas de personas sanas. Hayashi et al. descubrió que, entre las muchas pruebas de tejido obtenidas de pacientes con crecimiento de cáncer de ovario , HDAC1 y HDAC2 se relacionan principalmente con la expansión de células enfermas, mientras que HDAC3 se asocia con formas de movimiento celular. Obstaculizar HDAC3 provoca el obstáculo del movimiento de las células de la enfermedad. Asimismo, la articulación HDAC se expande entre pacientes con crecimiento de cáncer de ovario que es impermeable a la quimioterapia basada en platino. Asimismo, HDAC4 y HDAC6 se asocian con obstrucción del crecimiento y movimiento malignos de ovario. Lapinska et al. Demostró que los tratamientos combinados con inhibidores de HDAC podrían tener éxito contra varios tipos de crecimientos de cáncer de ovario .
Materiales y métodos
Materiales : la mezcla de nutrientes/medio Eagle modificado F-12 de Dulbecco (DMEM/F-12) se obtuvo de Gibco por Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.). El medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), RPMI-1640, suero fetal tipo buey (FBS, inactivado por calor), penicilina y estreptomicina se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE. UU.). La leptina se adquirió de Sigma Chemical Co. Los enemigos de los receptores de leptina (SHLA, Lan1 y Lan2) se adquirieron de Protein Laboratories Rehovot (PLR) Ltd. (Rehovot, Israel).
Cultivo celular : OVCAR-3 (establecido a partir de la ascitis dañina de un paciente con adenocarcinoma de ovario dinámico después de una quimioterapia combinada con ciclofosfamida) y CaOV-3 (una línea celular de crecimiento maligno de ovario esencial), se adquirieron de la American Type Culture Collection. (Manassas, Virginia, EE. UU.). Las células COV434 se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE. UU.). Los atributos orgánicos de esta línea celular se han descrito recientemente (20). Las células KGN se obtuvieron de Masatoshi Nomura y Hajime Nawata, Universidad de Kyushu, Japón (21). Las células CaOV-3 se refinaron de forma rutinaria en DMEM con FBS al 10 % y OVCAR-3 en RPMI-1640 mejorado con FBS al 20 %. Células COV434se refinaron rutinariamente en DMEM + glutamina 2 mM + FBS al 10 %. Las células KGN se refinaron rutinariamente en DMEM/F-12 + FBS al 10 %. Las células se desarrollaron en placas de cultivo de tejidos de 75 cm2 (Nunc, Dinamarca) en un criadero a 37 °C con una mezcla humidificada de 5 % de CO2:95 % de aire.
Análisis qPCR : qPCR dictó la articulación de la calidad HDAC basal y la declaración de las cualidades HDAC afectadas por la leptina y los rivales de la leptina. Las células se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos con un grosor de 1,5×104 células/pocillo (CaOV-3), 1,5×103 células/pocillo (OVCAR-3), 8×103 células/pocillo (COV434) y 1,5×104 celdas/pocillo (KGN) reflexionando sobre el tamaño de las celdas y el tiempo de multiplicación de la población. Al día siguiente, se cambió el medio y las células se trataron con leptina a razón de 40 ng/ml sola o con SHLA y leptina.
Análisis de transferencia Western : las células se sembraron en placas de 24 pocillos con un grosor de 2 × 105 (CaOV-3), 3,5 × 104 (células OVCAR-3), 4 × 104 (células COV434) y 6 × 104 (células KGN) y autorizado a conectarse por el momento. Al día siguiente, se cambiaron los medios y las células se trataron con 40 μg/ml de leptina sola o mezclada con 1000 μg/ml de SHLA o Lan2. Para observar la articulación de la proteína HDAC, las células se incubaron durante 48 h. Después de la crianza, las células se lavaron con PBS súper frío y se lisaron con una cuna de lisis Laemmli (Sigma Chemical Co.). A continuación, las células lisadas se rasparon, se trasladaron a microtubos y se guardaron a -70 °C hasta su análisis.
Se aislaron cantidades iguales de proteína (50 μg) de cada grupo de tratamiento mediante SDS-PAGE y se trasladaron a capas de PVDF utilizando el ensamblaje mecánico Bio-Rad Mini-Protean 3 (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, EE. UU.). Las manchas se criaron por el momento con anticuerpos esenciales específicos para HDAC5, HDAC6 y HDAC7 (n.º 20458S, n.º 7558S, n.º 33418S Cell Signaling Technology Inc., Beverly, MA, EE. UU.) con una reducción de 1:1000. Después de eclosionar con la respuesta inmunitaria esencial, las ponedoras se lavaron varias veces con Tween-20 al 0,1 % en un cojín de TBS 0,02 M y se criaron durante 1 h con un agente antagonista auxiliar conjugado con peroxidasa de rábano picante (#7074 Cell Signaling Technology Inc. ; debilitamiento 1:2,000).
Ensayo de actividad de histona desacetilasa : la actividad HDAC se estimó utilizando el kit de ensayo fluorométrico de actividad HDAC in situ (EPI003, Sigma Chemical Co.). Las medidas del elemento fluorescente se estimaron utilizando un lector de microplacas de fluorescencia (FLx800 Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, EE. UU.) a una frecuencia de excitación de 368 nm y una frecuencia de salida de 442 nm. Todos los ejemplos se ejecutaron por cuadruplicado en un examen similar.
Análisis estadístico : la información se comunicó como media ± SEM de las cuatro investigaciones autónomas realizadas por triplicado. Se realizaron exámenes medibles utilizando GraphPad Prism 5. Los datos se investigaron utilizando un examen de fluctuación de dos vías (ANOVA) seguido de una prueba de rango variable de contraste realmente crítico (HSD) de Tukey. Una estimación de p<0,05 se consideró objetivamente crítica.
Resultados: Impacto de la leptina y los enemigos del receptor de leptina en la calidad de HDAC y la articulación de proteínas en células de cáncer epitelial de ovario. En la línea celular OVCAR-3, la declaración de todas las HDAC exploradas fue en conjunto más alta que en las células CaOV-3, con la articulación más notable observada para las HDAC 1, 2, 3 y 7. La leptina amplió la declaración de la HDAC 1, 7 y 9 calidades. De los bloqueadores de segunda mano, SHLA no solo revirtió el efecto estimulador de la leptina en las cualidades y proteínas HDAC 1 y 9, sino que también disminuyó la declaración de la calidad HDAC 4, la calidad y proteína HDAC 5 y la proteína HDAC6. Lan-2 no tuvo impacto en la articulación de calidad HDAC, sin embargo, se observó un sólido impacto inhibidor en la declaración de la proteína HDAC9.
Discusión: La articulación elevada de numerosas proteínas de la clase HDAC se ha representado en el 60-90 % de los tumores de ovario y se han descrito numerosos cambios en los que intervienen histonas y no histonas que modifican la ecualización para el desarrollo y la resistencia celular.
La información introducida indicaba claramente una articulación de calidad HDAC en conjunto más alta en las células epiteliales que en las de la granulosa. Además, demostraron que en la línea celular quimiorresistente OVCAR-3, el flujo de salida de todas las HDAC exploradas fue esencialmente mayor que en las células esenciales CaOV-3, con la articulación más notable para las HDAC 1, 2, 3 y 7. En el tumor de la granulosa Se observó una articulación HDAC más baja en la estructura adulta que en la estructura adolescente, con la articulación más notable de HDAC9 encontrada en las células COV434. Con la excepción de la alta articulación de HDAC7 en OVCAR-3 y HDAC9 en COV434 de clase II, en todos los casos, la declaración de HDAC de clase I fue mayor que la de clase II. La mayoría de los estudios indicaron la articulación mejorada de las HDAC de clase I en tumores humanos fuertes y en pacientes con progresión privada, Tumores desdiferenciados que se multiplican enfáticamente. Hay una serie de pruebas en desarrollo de que la salida de HDAC de clase I se expande en los carcinomas de ovario, y esto se relaciona no solo con asumir un papel destacado en la carcinogénesis, sino también con
contribuyendo a la protección de los especialistas en quimioterapia utilizados para recompensar el crecimiento del cáncer de ovario . Esto coincide con nuestra percepción de que la articulación más elevada se observó en las células OVCAR-3.