Revista de Investigación y Desarrollo
Acceso abierto
ISSN: 2311-3278
ISSN: 2311-3278
Igor L Katkov
Abstracto
Introducción: Las células madre pluripotentes humanas (hPSC) tienen un buen potencial para la terapia celular y la medicina regenerativa y como herramientas útiles para demostrar la embriotoxicidad in vitro. La crioconservación (CP), el almacenamiento y el envío de hPSC son elementos clave para eventuales aplicaciones clínicas que necesitarán grandes cantidades de células madre pluripotentes con control de calidad. Si bien los protocolos efectivos de CP para líneas celulares regulares e incluso células madre embrionarias murinas (mESC) están bien establecidos, este no es el caso para hPSC debido a las bajas tasas de recuperación de células viables y pluripotentes.después de la congelación y la lenta tasa de crecimiento de hESC, por lo que el tiempo desde la descongelación hasta obtener cultivos adecuados para la experimentación puede ser una semana. Este problema no es simplemente un inconveniente debido a que los períodos de cultivo prolongados ejercen una mayor presión selectiva sobre la población celular, mejorando la probabilidad de variación fenotípica y/o alteraciones en la potencia.
Materiales y métodos generales: Derivación de hESC-iPSCs - Célulasse cultivaron en medio de Eagle modificado por Knockout Dulbecco (KODMEM, Invitrogen, n.° 10829-018) suplementado con L-glutamina 1 mM con medio de reemplazo de suero Knockout al 20 % (KOSR, Invitrogen), piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM ( NEAA, Invitrogen), 50 U/ml de penicilina, 50 µg/ml de estreptomicina (Invitrogen), 0,1 mM de beta-mercaptoetanol (Invitrogen) y 8 ng/ml de factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF, Sigma n.º F0291-25UG). Las hESC y las hiPSC se cultivaron en placas de 6 pocillos recubiertas con Matrigel (factor de crecimiento reducido, BD Bioscience) (Corning, Inc. n.º 3506) en una capa alimentadora de MEF primarios de ratones E13.5 CD-1. Las líneas H9 y hiPSC se sometieron a pases después de la digestión enzimática con colagenasa IV (Invitrogen, nº 17104-019) aproximadamente cada 7 días. Célulasse sometieron a pruebas de rutina para micoplasma (MycoAlert; Cambrex, Walkersville, MD).
Generación de fibroblastos derivados de H9: las células H9 no diferenciadas se sometieron a un protocolo de discriminación espontánea regular a través de la formación de EB. Brevemente, las colonias de hESC tratadas con colagenasa IV se distribuyen mediante trituración mecánica con pipeta en agregados celulares de 500 a 800 células.
Generación de células iPS humanas : aplicamos el protocolo estándar de Yamanaka con modificaciones menores. Los vectores retrovirales pMXs originales que codifican hOct4, hSox2, hKlf4 y hc-Myc se recolectaron de Addgene y se pseudotiparon con proteína envolvente VSV-G (un regalo de Gerald Pao, Salk Institute). Los hdF semiconfluentes se convirtieron durante la noche y el sobrenadante contenía los cuatro virus.
Inmunoquistoquímica: las células se enjuagan con PBS, se microfotografían en campo claro (BF) en un microscopio invertido CKX 41 y se sedimentan con paraformaldehído (PFA) al 4 % diluido en PBS durante 10 min a temperatura ambiente (RT).
M & M Particulares y Resultados: Toxicidad de Cuatro Crioprotectores Diferentes. Anteriormente planteamos la hipótesis de que el DMSO puede ser intrínsecamente tóxico para las hPSC y debe sustituirse por un CPA no tóxico. En un estudio piloto, identificamos que el etilenglicol (1,2-etanodiol, EG) brindaba la misma protección en la crioconservación de células 293 , por lo que consideramos este diol como el mejor candidato para la sustitución del DMSO. También probamos propilenglicol (1,2-propanodiol, PG) y glicerol (GLY). Las células se expusieron al 10 % (p/p) de CPA durante 30 min a 37 ºC. La recuperación de la célula CalceinPM+/7AAD está comparativamente bajo control (QUANTA permite la medición precisa de la concentración celular que se convirtió en rendimiento celular total). Después de esas célulasse separan y se colocan en placa según el procedimiento de rutina, y el día 2, antes del primer cambio de medio, también se recolectaron las células no adheridas. La eficiencia de unión promedio del control no tratado estuvo en un rango de 65 a 77 %, y prácticamente el 95 % de las células iPS adheridas fueron nanogpositivas después de 2 días de incubación. Criopreservación de células iPS disociadas : como se describió anteriormente, el desprendimiento de células de las superficies que contienen moléculas de MEC puede provocar la diferenciación y la muerte celular masiva. Sin embargo, desde una perspectiva criobiológica, la CP de suspensiones de células individuales es preferible a las agrupaciones. Abordamos este problema agregando un inhibidor de Rho-quinasa (ROCK) Y-27632 (RI en el texto) que ayuda a las célulassoportar el desapego y la disociación. Células unidas por criopreservación en placas: dado que el protocolo de congelación estándar requiere desprendimiento, planteamos la hipótesis de que la recuperación podría mejorarse si las células no se perturbaran en sus entornos "naturales". Por lo tanto, congelamos las células en placas de 4 pocillos.
Discusión: Si bien muchos aspectos de estos desarrollos se utilizaron en protocolos previamente documentados; sin embargo, los resultados informados difieren ampliamente entre laboratorios y líneas celulares. Nuestra clara distinción e innovación fue utilizar los datos acumulados en concierto como un todo. Otro problema es que una amplia variedad de métodos de evaluación de la recuperación usados en las publicaciones antes mencionadas hace que la comparación cuantitativa directa de diferentes resultados sea muy difícil, si no a veces imposible. Hemos decidido no utilizar ningún ensayo de colonias debido a la gran variabilidad del tamaño y la cantidad de colonias que se pueden sembrar en un pozo en particular, lo que hace que el "número de colonias" sea un parámetro poco confiable para la cuantificación. En su lugar, usamos el número (% de la cantidad total de células recolectadas) de células positivas para GFPque excluyó un marcador de viabilidad negativo 7AAD como característica de las células unidas. También calculamos con precisión (usando la opción de contador QUANTA Coulter) la cantidad de células no adheridas y adheridas porque también era imposible sembrar la misma cantidad de células por pocillo incluso si las células se disociaban antes de congelar y sembrar, y especialmente si estaban congeladas en grumos. Esa combinación de la evaluación de las células que se volvieron a adherir a la superficie del pocillo frente a las células flotantes no adheridas y el porcentaje de células reconstituidas viables positivas para Oct4 (7AAD-)nos dará una evaluación justa de la recuperación general, como en el rendimiento de SC pluripotentes viables después de CP (VY).
Conclusiones: tanto la disociación de las iPSC con Accutase en la apariencia de un inhibidor de ROCK y el etilenglicol Y la congelación programable en la etapa adherente (ComfortFreeze) han mejorado drásticamente (hasta 6 veces) el rendimiento de las células madre pluripotentes crioconservadas es una congelación comparativamente estándar en grupos sin inhibidor de ROCK. La crioconservación de células adherentes en placas también ha demostrado una mayor eficacia y un menor tiempo para la restauración de las colonias al nivel descongelado que la disociación con Accutas.
Nota: Este trabajo se presentó parcialmente en el 21.er Congreso Europeo de Biotecnología los días 11 y 12 de octubre de 2018 en Moscú, Rusia.