Revista de Investigación y Desarrollo
Acceso abierto
ISSN: 2311-3278
ISSN: 2311-3278
Valeria Zabelina
Las proteínas recombinantes se expresan en diferentes organismos huéspedes. Escherichia coli (E. coli) es el huésped de producción no mamífero más utilizado para productos biofarmacéuticos de complejidad moderada. Los anticuerpos completos son actualmente los productos biofarmacéuticos más vendidos; sin embargo, una clase nueva y fundamental de productos biofarmacéuticos incluye fragmentos derivados de anticuerpos y pequeñas proteínas de unión a andamios. Estas proteínas se unen a dianas específicas, que activan o bloquean reacciones clave in vivo. Son más pequeños que los anticuerpos, lo que les otorga un mayor potencial de penetración tisular (p. ej., pueden cruzar la barrera hematoencefálica); por lo tanto, se incrementa el número de objetivos accesibles. Los fragmentos de unión a antígeno (Fab) son brazos de unión únicos, monovalentes, derivados de moléculas de inmunoglobulina G (IgG). Los Fab están compuestos por una cadena ligera (LC) y una cadena pesada (HC), conectadas por un enlace disulfuro. Debido al pequeño tamaño molecular y la complejidad reducida de estos fragmentos, los sistemas de expresión basados en E. coli son una alternativa atractiva a los cultivos de células de mamíferos.
Construcción de plásmidos Fab - Todas las enzimas y kits se adquirieron de New England Biolabs (NEB, Ipswich, EE. UU.). Los genes que codificaban fragmentos Fab fusionados con la secuencia señal líder (OmpA SS ) se adquirieron de ATUM (Newark, EE. UU.) . Las secuencias líder y espaciadora eran constantes para todos los Fab, pero las secuencias que codificaban los Fab tenían codones optimizados. Todos los Fab tenían la misma secuencia aa en la región constante pero diferentes secuencias específicas de Fab en la región variable. Para los sistemas PB, clonamos las secuencias Fab en el vector de expresión, pET30a, a través de los sitios de restricción Nde I y Eco RI. Realizamos reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) para reemplazar la secuencia de señal de OmpA (OmpA SS ) con la secuencia de señal de DsbA (DsbASS ). Fab LC y HC se amplificaron por separado con cebadores sentido que portaban una secuencia DsbA SS sobresaliente (LC con Nde I_DsbA SS ‐Fab_sense, HC con Bsa I_DsbA SS ‐Fab_sense): el cebador antisentido para la amplificación de LC se unió al extremo 3′ de UTR enlazador (Bsa I_UTR enlazador _antisense).
Integración de Fabs en el genoma de E. coli : los Fabs se amplificaron a partir de vectores pET30a con los cebadores TN7/1_pET30a_for y TN7/2_pET30a_back (Tabla S1, Información de apoyo). Debido a los excesos del cebador, el casete de integración estaba flanqueado por secuencias de 50 pb que se aparearían con el sitio genómico TN7 para la integración. La integración del genoma se realizó según lo descrito por Sharan et al.
µ - Cultivo con biorreactor : se utilizó el sistema µ-biorreactor, BioLector (m2p-labs GmbH, Baesweiler, Alemania), para el cultivo. Realizamos dos tipos de cultivos. Los precultivos se cultivaron en Flowerplates B de 48 pocillos (m2p‐labs GmbH) sin optodes; los cultivos principales se cultivaron en Flowerplates‐BOH (m2p‐labs GmbH) equipados con optodos para mediciones en línea del oxígeno disuelto (OD) y el valor de pH. Ambos tipos de placas acomodaron un volumen de trabajo de 800 µL. Los precultivos se iniciaron a partir de células raspadas de un banco de células de investigación congeladas y se cultivaron en caldo Luria-Bertani (Merck, Darmstadt, Alemania) a 37 °C. El cultivo principal se inició a partir de precultivos, con una densidad celular inicial de OD 600 = 0.3, y cultivadas a 30 °C. El cultivo principal se cultivó según protocolos desarrollados previamente en nuestro grupo.
Lisis celular:
Los sedimentos de células congeladas se descongelaron y se resuspendieron en 200 µL de tampón de lisis (30 mm Tris, pH 8,2, 10 mm MgCl 2, 30 mm de ácido etilendiaminotetraacético). Luego, se agregaron lisozima (Merck) y benzonasa (Sigma‐Aldrich) a concentraciones finales de 10 000 U y 2.5 U, respectivamente. Después de 10 min de agitación vorticial, se añadió Triton X-100 al 1,5 %. El lisado se incubó en el vórtice durante otros 10 min. Los restos celulares se eliminaron con una centrifugación de 10 min a 15 000 × g a 4 °C. La fracción de cuerpos de inclusión (IB) se lavó dos veces con 100 mm de Tris, pH 8,2, y se solubilizó mediante agitación en 8 m de urea y 100 mm de Tris, pH 8,2, durante 30 min. Los volúmenes finales de la fracción soluble y la fracción IB resolubilizada fueron iguales. Los desechos se sedimentaron a 15 000 × g durante 10 min y tanto la fracción soluble como la IB se almacenaron a -20 °C hasta su análisis.
Análisis de expresión Fab:
La expresión de Fab soluble se determinó con un ELISA sándwich que solo detecta Fab ensamblado correctamente. El anticuerpo de captura se une solo a la LC, mientras que el anticuerpo de detección reconoce específicamente la región bisagra de la HC. Para estar en el rango de la curva estándar de ELISA, el rango de concentración de Fab se estimó inicialmente mediante análisis de transferencia Western (WB). En consecuencia, las fracciones solubles de los lisados celulares se ajustaron con un tampón de dilución (1x solución salina tamponada con fosfato [PBS], que contenía Tween 20 al 0,1% y albúmina de suero bovino al 1%; Merck). Se utilizó Fab/κ humano purificado (Betilo P80-115; Montgomery, EE. UU.) de 0,78 ng mL -1 a 100 ng mL -1 para calcular una curva estándar. Recubrimos placas de 96 pocillos con anticuerpo de cabra IgG antihumano (específico de Fab) diluido 1:400 en tampón de recubrimiento (100 mm NaHCO 3 y 40 mm Na 2 CO 3 , pH 9,6–9,8). Las placas se lavaron con PBS 1x, que contenía Tween 20 al 0,1 %, en un lavador de microplacas HydroFlex. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente (TA) durante 1 h para permitir que se unieran los anticuerpos de captura. Se aplicaron anticuerpos IgG de ratón antihumanos que reconocen específicamente la región bisagra y luego anticuerpos de cabra IgG antiratón conjugados con peroxidasa como anticuerpos de detección, ambos diluidos 1:1000, y cada uno se incubó durante 1 h a temperatura ambiente.
Discusión:
Demostramos claramente que los sistemas de expresión sin plásmidos podrían facilitar en gran medida una caracterización directa de la respuesta de la célula huésped a la producción de Fab. La integración dirigida al sitio de una sola copia de GOI en el genoma de la célula huésped elimina los efectos sobre el metabolismo del huésped desencadenados por variaciones en el número de copias de plásmidos, la expresión del gen de resistencia a antibióticos codificado por plásmidos y la replicación de plásmidos. Al eliminar estos factores de confusión, los efectos de la producción de Fab sobre el metabolismo de la célula huésped se vuelven claramente evidentes.
Conclusiones:
Recomendamos que los huéspedes de expresión GI sean los sistemas de elección para la caracterización directa de la respuesta de la célula huésped a la expresión de proteínas recombinantes. Nuestros resultados confirmaron que los sistemas de producción GI fueron superiores a los sistemas PB convencionales para las proteínas recombinantes translocadas al periplasma. Demostramos la idoneidad de los sistemas GI, como parte central de nuestra configuración, para estudios fundamentales, y como un sistema alternativo atractivo para la producción de proteínas. Con base en el conocimiento adquirido y la plataforma que desarrollamos, hemos proporcionado una buena base para la respuesta más detallada de la célula huésped y las caracterizaciones del proceso utilizando sistemas de producción de IG en fermentaciones discontinuas de sobremesa.
Nota: Este trabajo se presentó parcialmente en el 21.er Congreso Europeo de Biotecnología los días 11 y 12 de octubre de 2018 en Moscú, Rusia.