Clonación y transgénesis
Acceso abierto

abstracto

Diseño y reconstrucción del vector de expresión de mamíferos pcDNA 3.0 con sus múltiples sitios de clonación mediante el método de clonación direccional

Sheeba Naaz, Syed Naqui Kazim

La clonación tradicional es la clonación en la que usamos endonucleasas de restricción para producir fragmentos de ADN con secuencias finales complementarias específicas que se pueden unir con una enzima ADN ligasa, antes de la transformación. El propósito de este estudio fue reconstruir el vector de expresión de mamífero reemplazando el ADN basura con sus múltiples sitios de clonación naturales. El plásmido se propagó y digirió con las enzimas Xho1 y Kpn1 de ambos lados del ADN basura. Se cortó un ADN de 600 pb del vector y luego se ligó el cebador de 30 pb que se diseñó de manera similar a sus múltiples sitios de secuencia. La inserción correcta fue confirmada por aislamiento del plásmido, PCR de colonias de plásmidos, PCR del plásmido clonado y comparación en electroforesis en gel con el original y finalmente por secuenciación. Se cortó del vector un fragmento extra de ADN de 600 pb después de la digestión de restricción. Aparecieron colonias ligadas en la placa de agar a partir de la cual se produjeron productos de PCR de colonias de 60 pb. El aislamiento del plásmido después de la clonación y la PCR de colonias y la PCR del plásmido clonado confirmaron la clonación. La clonación de múltiples sitios de clonación en el vector de expresión de mamíferos pcDNA3.0 se realizó con éxito. La ligación de múltiples sitios de clonación en el vector pcDNA proporcionó varios sitios de reconocimiento de enzimas de restricción para una clonación simple y rápida.