Ingeniería enzimática
Acceso abierto

abstracto

Diseño de una α-L-transfucosidasa para la síntesis de HMO fucosilados

Dora Molnar-Gabor

Se reconoce que los oligosacáridos de la leche humana (HMO) benefician a los lactantes de múltiples formas. Como resultado, existe un interés creciente en la síntesis de HMO que imiten su diversidad natural. La mayoría de los HMO son oligosacáridos fucosilados. Las α-L-fucosidasas catalizan la hidrólisis de α-L-fucosa del extremo no reductor de un glucano. Pertenecen a las familias de glucósido hidrolasa GH29 y GH95. Las fucosidasas de la familia GH29 muestran un mecanismo de retención clásico y son buenas candidatas para la actividad transfucosidasa. Recientemente demostramos que la α-L-fucosidasa de Thermotoga maritima (TmαFuc) de la familia GH29 puede convertirse en una transfucosidasa eficiente mediante evolución dirigida (Osanjo et al. 2007). En este trabajo, desarrollamos enfoques semirracionales para diseñar una α-L-transfucosidasa a partir de la α-L-fucosidasa de la bacteria comensal Bifidobacterium longum subsp. infantis (BiAfcB, Blon_2336). Se obtuvo una fucosilación eficiente con enzimas mutantes (L321P-BiAfcB y F34I/L321P-BiAfcB) que permitieron la síntesis in vitro de lactodifucotetraosa, lacto-N-fucopentaosa II, lacto-N-fucopentaosa III y lacto-N-difucohexaosa I. Las enzimas también generaron HMO más complejos como para-lacto-N-neohexaosa fucosilada (F-p-LNnH) y lacto-N-neohexaosa mono- o difucosilada (F-LNnH-I, F-LNnH-II y DF-LNnH). Vale la pena señalar que la mutación en estas dos posiciones no resultó en una fuerte disminución en la actividad general de la enzima, lo que hace que estas variantes sean candidatas interesantes para reacciones de transfucosilación a gran escala. Por primera vez, este trabajo proporciona un método enzimático eficiente para sintetizar la mayoría de los HMO fucosilados.