Revista de bioquímica y fisiología vegetal
Acceso abierto
ISSN: 2329-9029
ISSN: 2329-9029
Ankita Shrestha, Ahamed Khan y Nrisingha Dey
El único método CRISPR-Cas9 de reconocimiento de ADN guiado por ARN es un método simple y poderoso herramienta para la ingeniería genómica dirigida. Aquí, informamos el diseño y las pruebas de vectores binarios derivados de promotores de caulimovirus eficientes para realizar la edición del genoma empleando el sistema CRISPR-Cas9-gRNA. Para tal mutagénesis dirigida, creamos vectores de transformación binarios para impulsar la expresión de Cas9 por un promotor caulimoviral eficiente, ‘M24’ aislado y caracterizado del Mirabilis Mosaic Virus (MMV). Los ARN guía (g) CRISPR de 20 nucleótidos se diseñaron para inducir mutaciones específicas en el gen CYP82E4-nicotina N-desmetilasa (nnd) del tabaco (Nicotiana tabacum). Para editar el gen nnd, empleamos un par de gRNA seguidos por el motivo adyacente protospacer (PAM) dirigido al primer exón del nnd-ORF. Evaluamos el porcentaje de “indels” usando células de protoplastos de tabaco donde las frecuencias de mutagénesis se registraron como 45% y 30% para los dos objetivos respectivamente. Se obtuvo una eficacia de mutagénesis del 37% tras la transfección simultánea de los dos ARNg en protoplastos de tabaco. La demostración exitosa de nuestro sistema CRISPR-Cas9-gRNA basado en caulimovirus es un buen augurio para su uso a corto plazo como un medio potencial y sencillo para realizar la edición genómica dirigida en plantas.