Revista internacional de minería de datos biomédicos
Acceso abierto
ISSN: 2090-4924
ISSN: 2090-4924
Zehra Tatli, Matthew DeLisa y Eda Celik
Abstracto
Los compuestos de celulasa de bajo costo, pH y termoestables son un factor importante para la creación industrialmente adecuada de bioetanol, que es una fuente sostenible de vitalidad. En estos días, el costo de la celulasa representa el 40-50% del costo absoluto de producción de etanol y se espera que se reduzca 5 veces para los negocios .competencia. En lugar de materias primas alimenticias, como el maíz y la barra de azúcar, el etanol obtenido de la biomasa celulósica por endoglucanasa tipo celulasa reducirá los costos de producción. En este procedimiento, la decisión de la célula huésped es crítica para desarrollar formas de creación progresivamente conservadoras. La bacteria Escherichia coli es uno de los huéspedes más favorecidos para la creación de proteínas recombinantes. Por otra parte, se sabe que los productos químicos administrados en sistemas bacterianos son cada vez más prácticos en comparación con las células eucariotas , ya que pueden liberarse en grandes cantidades. En esta situación específica, a partir del codón tardíoEl nuevo compuesto Cel5A mejorado se comunicó de forma intracelular y extracelular en E. coli y los estudios de desarrollo de bioprocesos se rastrearon mediante pruebas de transferencia de proteínas espectrofotométricas y de transferencia de Western. Expandimos el movimiento de compuestos intracelulares 50-pliegues hasta 0,74 UI/mL y la acción de proteínas extracelulares 5-superposición hasta 1,5 UI/mL. El catalizador de celulasa recombinante y el bioproceso creado en esta investigación tienen una importancia fundamental para superar los cuellos de botella en el segmento de los biocombustibles y la vitalidad.
La bacteria Gram-negativa Escherichia coli se ha utilizado generalmente como una planta de procesamiento de células para la producción de proteínas y se dice que son brebajes sintéticos, ya que es el huésped mejor retratado con numerosos marcos de referencia y articulación accesibles. Sea como fuere, las proteínas recombinantes liberadas en Escherichia coli son comúnmente intracelulares y se encuentran regularmente como cuerpos de consideración. La producción extracelular de proteínas es valiosa en comparación con la creación intracelular porque las proteínas extracelulares se pueden limpiar de manera más efectiva y pueden evitar la proteasa .Asalto, lo que provoca una mayor calidad del artículo. En este examen, encontramos un área sinérgica de una celulasa (Cel-CD) y su extremo N puede utilizarse como transportadores para la creación extracelular de proteínas recombinantes.
Introducción
La bacteria Gram-negativa Escherichia coli se ha utilizado generalmente como una planta de fabricación de células para la creación de compuestos y proteínas restauradoras, ya que es el huésped mejor descrito con numerosos dispositivos de articulación y guía accesibles. En cualquier caso, las cepas de E. coli de las instalaciones de investigación básica son indefensas secretoras de proteínas en condiciones de cultivo ordinarias, ya que esta bacteria tiene una envoltura celular alucinante con dos capas. De esta manera, las proteínas heterólogas creadas en E. coli recombinante son comúnmente intracelulares y regularmente como cuerpos de incorporación, de los cuales las proteínas naturalmente dinámicas deben recuperarse mediante procedimientos complicados y costosos. La creación extracelular de proteínas heterólogas en E. coli no solo brindará un proceso de creación y refinamiento básico y útil, sino que también brindará un proceso rápido y directocapacidades de cribado para proteínas o compuestos restauradores diana que se comunican de forma heteróloga en E. coli recombinante.
Se ha realizado un esfuerzo crítico para administrar las proteínas diana de forma extracelular en E. coli, con los esfuerzos de exploración divididos en dos clases. (1) Recolección dirigida de la proteína heteróloga en el espacio periplásmico a través de la capa interna (IM) usando un péptido pionero, como PelB, luego la proteína heteróloga se descarga al medio a través de la película externa (OM) usando la célula monstruos de envoltura o proteínas de lisis; (2) Fusión de las proteínas heterólogas a cómplices combinados que pueden ser emitidos desde el citosol fuera de los teléfonos a través de marcos conocidos u oscuros.
Varios péptidos de signosse han utilizado para la creación secretora de proteínas recombinantes tanto en eucariotas como en procariotas. La disposición de la señal común generalmente se encuentra en el extremo amino de las proteínas que funciona como una señal de atención y reconocimiento y contiene un sitio de escisión que puede ser cortado por una peptidasa de señal especial después del transporte. En cualquier caso, las proteínas recombinantes combinadas con el agrupamiento de señales se trasladan al espacio periplásmico en lugar del medio de cultivo debido a la estructura de dos capas de E. coli. Para descargar las proteínas objetivo al medio de vida, se utilizaron monstruos de la envoltura celular o proteínas de lisis. En cualquier caso, también experimenta la pureza de las proteínas descargadas y la afectación celular al suelo debido al derrame de la envoltura celular.
Con respecto a la utilización de la metodología subsiguiente, se observó que algunas proteínas, incluidas las proteínas heterólogas, se emitían legítimamente al medio a partir de E. coli recombinante. Sea como fuere, solo se examinaron algunas proteínas como cómplices combinados para la creación de proteínas recombinantes extracelulares, debido a que la eficacia de emisión y la inclusión no eran suficientes para escalar a un volumen de articulación mayor. En 2005, Majander et al., alteraron el ensamblaje mecánico de descarga flagelar tipo III de E. coli. Luego, al combinar una proteína heteróloga entre el distrito no traducido de 173 pb aguas arriba del fliC de calidad (que codifica la flagelina) y un eliminador transcripcional de fliC, encontraron que las proteínas objetivo se pueden descargar en el medio a través del dispositivo de emisión de tipo III a niveles de 1 a 15 mg/L. Por lo tanto, los científicos identificaron un péptido bacteriano endógeno de 13 kDa en E. coli, YebF, que puede descargarse en el medio en cantidades generalmente enormes mediante un proceso de dos pasos a través del espacio periplásmico. Recientemente, se distinguió una proteína Y inducible osmóticamente (OsmY) de E. coli BL21 (DE3) utilizando una técnica proteómica. OsmY también se puede descargar del coli BL21 (DE3) se distinguió utilizando una técnica proteómica. OsmY también se puede descargar del coli BL21 (DE3) se distinguió utilizando una técnica proteómica. OsmY también se puede descargar delcélulas con proteínas objetivo en focos que se encuentran en algún lugar en el rango de 5 y 64 mg/L. Además, ESETEC®, el marco de descarga autorizado de WACKER, una innovación para crear proteínas y partes de agentes que contrarrestan una cepa protegida de E. coli K12, fue la respuesta comercial única para nuestra información.
Lo que es más importante, comúnmente se considera que ningún marco de descarga combinado es apropiado para cada proteína heteróloga individual, ya que parece que los marcos cómplices de combinación actuales tienen limitaciones. En este examen, informamos que el área reactiva de una celulasa (Cel-CD) de Bacillus sp.Z-16 puede emitirse de manera efectiva desde E. coli cuando se sobreexpresa heterólogamente. La recolección de Cel-CD en el medio way of life llegó a 514 mg/L. Como la celulasa asume un papel importante en el cambio de biomasa celulósica, la articulación extracelular de Cel-CD en E. coli da paso a la creación de celulosa. Tanto el Cel-CD como su agrupación N-terminal tienen potencial como cómplices de combinación en la creación de diferentes proteínas recombinantes.
Resultado
La ausencia de péptido señal en Cel-CD nos llevó a decidir su área subcelular. El E. coli BL21 (DE3) que contiene Cel-CD se analizó utilizando la estrategia de aturdimiento osmótico frío, como se describe en Materiales y métodos. Encontramos que Cel-CD estaba en el citoplasma, el espacio periplásmico y el medio, lo que demostró que la emisión de Cel-CD se produjo a través del espacio periplásmico mediante un examen de mancha occidental con anticuerpos contra Cel-CD. En una prueba resultante, agregamos cloranfenicol en el modo de vida para reprimir la biosíntesis de proteínas incipiente, y vimos que la cantidad de Cel-CD en el espacio periplásmico mostró un aumento subyacente y, por lo tanto, disminuyó en cantidad, aunque lógicamente se agregó en el medio. Estos descubrimientos muestran que la descarga de Cel-CD es un proceso de emisión de dos avances por medio del espacio periplásmico.
Para prohibir la probabilidad de que la recolección extracelular de Cel-CD se deba a la lisis celular o al derrame de células a través de la película externa, realizamos un examen de manchas occidentales contra Cel-CD junto con proteínas de control, la proteína restrictiva de maltosa periplásmica (MBP) y la proteína citoplasmática GroEL. . La proximidad de proteínas de control en el medio sería un signo de lisis celular. Cel-CD se distinguió en el medio de vida en cada punto de tiempo, aunque MBP no se reconoció y GroEL solo se identificó en las siguientes sumas después del desarrollo ampliado. Esto demostró que Cel-CD extracelular no se obtuvo a partir de la lisis celular.
Un informe en curso demostró que la cutinasa comunicada heterólogamente de Thermobifida fusca fue emitida por las células debido a su movimiento hidrolítico hacia los fosfolípidos. Para prohibir la probabilidad de que la descarga de Cel-CD también fuera provocada por su acción hidrolítica en el espacio periplásmico, el sitio dinámico de Cel-CD se transformó por los efectos de la disposición de sucesión corrosiva amino fraccional con celulasa. Todavía se identificaron en el medio dos anomalías, E160Q, E160Q y E274Q, en las que se perdió totalmente la acción hidrolítica (Figura 3B). La morfología de las cepas de E. coli BL21 (DE3) se analizó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Indicó que las célulasla comunicación de Cel-CD o Cel-CD inactivado permaneció impecable, lo que respalda el resultado mencionado anteriormente.
El lanzamiento productivo y cuantitativo de Cel-CD nos animó a probar la posibilidad de que pudiera utilizarse como un cómplice combinado o péptido señal/proteína para hacer otras proteínas de la célula en E. coli recombinante. Elegimos una progresión de proteínas con varios tamaños y fuentes, incluida la pectato liasa C (PelC, 24,3 kDa) de B. subtilis, la nuritina humana (NRN1, 15,3 kDa), el espacio restrictivo de azúcar de la ciclodextrina glicosiltransferasa (CBD, 11,21 kDa) de B. circulans, proteína restrictiva de maltosa (MBP, 43,4 kDa) y glicerofosforil diéster fosfodiesterasa (GlpQ, 40,8 kDa) de E. coli. Estas cinco proteínas deben identificarse en el citoplasma cuando se comunicaron sin agrupaciones de signos. En el punto en que se entrelazan aguas abajo de Cel-CD, cada una de estas proteínas se distinguió en el medio después de 24 h de desarrollo; sea como sea, los niveles de emisión fluctuaron. La emisión de Cel-CBD fue la más elevada, llegando a 348 mg/L. La emisión de Cel-glpQ, Cel-MBP, Cel-pelC y Cel-NRN1 en el medio de vida también fue considerable con estimaciones de 266,8, 307,6, 264,6 y 211,3 mg/L, individualmente.
Discusión
En este estudio, hemos demostrado que Cel-CD, el área sinérgica de una celulasa de Bacillus sp.Z-16, podría descargarse en el medio de vida sin un arreglo de señal común cuando se comunica en E. coli BL21 (DE3). Como proteína heteróloga, no se descubrió que la sobreexpresión de Cel-CD impediera el desarrollo y la digestión celular. Esto puede vencer la lisis celular provocada por la sobreexpresión del compañero combinado, por lo tanto, alarga el proceso de envejecimiento para construir la creación extracelular. Luego, la descarga de Cel-CD y sus proteínas recombinantes fue un proceso de dos avances, la condición oxidante y la disposición Dsb del periplasma benefician el desarrollo de enlaces disulfuro. Exámenes posteriores demostraron que Cel-CD también puede transmitirse y emitirse a partir de cepas de E. coli K, por ejemplo, E. coli BW25113, MG1655, sin embargo, el grado de descarga fue mucho menor. Por lo tanto, el uso de la combinación de Cel-CD no está subordinado a la tensión.
Hemos demostrado que la agrupación N-terminal de Cel-CD de longitud completa asume un trabajo clave en la descarga. Esto mostró que las acumulaciones corrosivas de 20 aminoácidos N-terminales de Cel-CD pueden completarse como un transportador para la emisión de proteínas objetivo heterólogas fuera de E. coli. En combinación con Cel-CD o N20, cinco eligieron proteínas que emitían al medio niveles significativos. La productividad de la descarga depende de las propiedades de las proteínas objetivo. Cel-CD tiene todas las características de ser apto para la emisión de proteínas de baja y baja disolubilidad dada su alta solvencia y enorme tamaño en E. coli, mientras que el péptido N20 es cada vez más apropiado para proteínas de gran tamaño. Sorprendentemente, todas las proteínas combinadas emitidas mostraron una solvencia relativamente alta; las proteínas combinadas con baja capacidad de disolución no se descargan productivamente. Proponemos que la solvencia de la combinación de proteínas es esencial para la descarga, mientras que la disposición N-terminal y la estructura tridimensional de la proteína son un factor importante. La combinación de proteínas heterólogas con N20 de Cel-CD puede hacer las proteínas objetivo de la célula. Este es el informe principal que muestra que un péptido corto puede completarse como un péptido señal y guiar proteínas heterólogas a través de las películas internas y externas de E. coli.
Conclusión
Las proteínas recombinantes creadas en Escherichia coli son comúnmente intracelulares y se encuentran con frecuencia como cuerpos de consideración. En este examen, se observó que un área sinérgica comunicada heteróloga de una celulasa (Cel-CD) en E. coli se descargaba fuera de las células en cantidades enormes con movimiento de endo-beta-glucosidasa. Mostramos que la agrupación N-terminal de Cel-CD asumió un papel importante en esta publicación, lo que sugiere que tanto Cel-CD como su extremo N se pueden utilizar como transportadores para la creación extracelular de proteínas recombinantes. La E. coli recombinante que comunica la proteína combinada de Cel-CD y diferentes tipos de compuestos hidrolíticos se puede utilizar para la formación de bioprocesos solidificados.