Revista de Antivirales y Antirretrovirales
Acceso abierto

abstracto

Clonación, expresión y purificación de formas recombinantes de glicoproteína EBOV de longitud completa y de dominio extracelular dentro de líneas celulares de mamíferos

Misaki Wayengera, Peace Babirye, Carol Musubika, Samuel Kirimunda, Moses L. Joloba

Antecedentes: glicoproteína (GP) de ébolavirus de longitud completa intercala la membrana lipídica más externa para formar picos, donde interviene en la interacción virus-célula huésped. Las 5 especies conocidas de Ebolavirus también producen una forma secretora de GP (sGP). Estos atributos hacen que GP sea un objetivo ideal para la investigación y el desarrollo (I y D) de Ebolavirus y, posiblemente, de panfilovirus, pruebas de diagnóstico rápido (RDT), productos bioterapéuticos y vacunas. La clonación anterior de Zaire recombinante ebolavirus (EBOV) GP ha utilizado principalmente sistemas de expresión de insectos (baculovirus). Informamos sobre la clonación, expresión y purificación de las formas de dominio extracelular y de longitud completa (ECD) de EBOV GP recombinante en líneas celulares de mamíferos.

Métodos y resultados: Se subdividieron secuencias de ADN codificantes de 2034 y 1956 pares de bases (bp) correspondientes a los residuos de 669 y 643 aminoácidos (aa) de longitud completa y formas ECD de EBOV GP. clonado en los plásmidos pTGE. Se utilizaron plásmidos pTGE recombinantes para transfectar células de mamífero 293-6E HEK cultivadas en medio de expresión FreeStyleTM 293 sin suero. Se usaron lisados celulares y/o sobrenadantes de cultivo para obtener proteína purificada, seguido de análisis en SDS-PAGE y Western blot. La GP de longitud completa purificada se detectó como proteína unida a la membrana en lisados celulares con un peso molecular estimado de ~100 kDa (Cal.M.W.~71,67 kDa) en Western blot; y 0,02 mg de GP (Concentración: 0,2 mg/ml, Pureza: ~50 %) derivados. Por el contrario, se detectó ECD GP en sobrenadantes de caldo de cultivo celular con pesos moleculares estimados de ~116 kDa basados en SDS-PAGE y Western blot; y se obtuvieron 1,6 mg (Concentración: 0,4 mg/ml, Pureza: ~70 %) de GP_ECD.

Conclusión: Dentro de las células de mamífero, la GP de EBOV de longitud completa recombinante se expresa predominantemente como proteína transmembrana (tGP), mientras que la GP de ECD se eluye en el medio de cultivo. Ambas formas recombinantes de GP son fundamentales para la I+D de las pruebas de diagnóstico rápido (PDR).