Revista de Proteómica y Bioinformática
Acceso abierto

abstracto

Amplia utilidad de una estrategia de enriquecimiento por afinidad para cadenas de poliubiquitina no ancladas

Jo Strachan, Barry Shaw, Varun Gopala Krishna, Daniel Scott, Juan C del Pozo, Kristine Hill, Madhav Gautam, Dorota Skowyra, Andrew D. Jacobson, Chang-Wei Liu, Neil J Oldham y Rob Layfield

La ubiquitinación de proteínas es una modificación postraduccional común donde los objetivos seleccionados se modifican covalentemente por la proteína ubiquitina, a menudo en forma de cadenas de poliubiquitina unidas a isopéptidos. Más recientemente, las cadenas de poliubiquitina no ancladas (es decir, no unidas a un sustrato) también se han descrito e implicado en una variedad de procesos biológicos. El desarrollo de entidades de unión a ubiquitina repetidas en tándem (TUBE), repeticiones diseñadas de dominios de unión a ubiquitina que interactúan de forma no covalente con poliubiquitina, ha permitido establecer estrategias para el enriquecimiento por afinidad de proteínas modificadas con ubiquitina, en algunos casos con especificidad de enlace. . Aquí, demostramos la utilidad de una entidad de unión a ubiquitina libre (FUBE), basada en un dominio de unión a ubiquitina con alta especificidad para el extremo C libre de ubiquitina (el dominio Znf-UBP de la USP5 humana). A diferencia de los TUBE que no distinguen la poliubiquitina conjugada o libre, el FUBE reconoce exclusivamente la ubiquitina en su forma no conjugada, incluidas las cadenas de poliubiquitina no ancladas endógenas. Los enriquecimientos por afinidad con FUBE demuestran que las cadenas de poliubiquitina no ancladas están presentes en diferentes líneas celulares de mamíferos y se acumulan cuando el proteasoma 26S se inhibe farmacológicamente, reteniéndose en el proteasoma. La alta conservación de la secuencia de ubiquitina permite que FUBE también se aplique a la purificación de cadenas de poliubiquitina no ancladas endógenas de especies tan diversas como Arabidopsis thaliana y Saccharomyces cerevisiae. El desarrollo y perfeccionamiento de una estrategia de enriquecimiento por afinidad para cadenas de poliubiquitina no ancladas abre el camino para investigaciones más completas sobre su importancia biológica.