Revista internacional de minería de datos biomédicos
Acceso abierto
ISSN: 2090-4924
ISSN: 2090-4924
Robert M. Brosh Jr.
Abstracto
El creciente número de helicasas involucradas en problemas hereditarios y crecimiento maligno es característico de sus trabajos básicos en un nivel muy básico en los intercambios de ADN, la seguridad genómica y la homeostasis celular. Sin duda, la prueba subatómica y celular muestra que las helicasas aflojan o modifican químicamente una variedad de sustratos nucleicos corrosivos e interactúan con varias proteínas para desarrollar sus capacidades de replicación, fijación de ADN, recombinación y registro. Ver cómo funcionan las helicasas de forma única y cubriendo las vías es una prueba extraordinaria para los científicos. La prueba reconocible y la representación de pequeños átomos orgánicamente dinámicos que equilibran el movimiento sinérgico de una helicasa objetiva habla de una forma única de abordar el trabajo de la helicasa en células humanas. En esta encuesta, representamos una progresión de enfoques y estrategias de prueba para reconocer y describir los inhibidores de la helicasa de ADN que, en general, brindan otra opción y una técnica valiosa para investigar su importancia natural en los marcos basados en células. Estos métodos se utilizaron en la revelación de agravantes naturalmente dinámicos que obstaculizaron el trabajo de aflojamiento del ADN catalizada por la helicasa-nucleasa WRN humana inadecuada en el estado de Werner de maduración prematura. Nuestras investigaciones con inhibidores de helicasa explícitos de WRN recién descubiertos han brindado verificación de prueba básica de cómo estas mezclas pueden utilizarse en métodos letales fabricados con otros operadores farmacológicos o en fundaciones anormales hereditarias caracterizadas. En este Taller de Ácidos Nucleicos 2017,reacción de estrés de replicación . Los inhibidores de helicasa brindan una metodología optativa para examinar los elementos atómicos y celulares de sus objetivos y, en un grado más amplio, la coordinación refinada para cubrir y cumplir las rutas metabólicas del ADN. Además, mi laboratorio y otros imaginan a las helicasas como pequeños focos de partículas apropiados que pueden mejorar los métodos existentes contra el cáncer o convertirse en nuevos medicamentos curativos.
Introducción
La detección y representación de pequeñas partículas naturalmente dinámicas que regulan la capacidad de aflojamiento del ADN de una helicasa objetiva habla de una forma novedosa de abordar el trabajo contemplado de la helicasa en células humanas. Hemos utilizado esta forma de abordar la investigación de los elementos atómicos y celulares de la helicasa-nucleasa WRN dañados en el estado de Werner de problema de maduración prematura. Al principio, estos exámenes se guiaron por una medida de helicasa basada en radiometría in vitro que utilizaba la proteína WRN recombinante limpia en la que se mezclaron alrededor de 500 del Instituto Nacional del Cáncer .Se proyectó el conjunto de diversidad del instituto. Un exacerbado que distinguimos para reprimir WRN con una potencia moderadamente alta en comparación con otras mezclas en la biblioteca del NCI fue 1-(propoximetil)-maleimida, asignado NSC 19630 (IC50 ~ 20 μM). Habiendo decidido el poder para el impedimento de la helicasa WRN, se investigó la claridad de las mezclas que intentaron enfáticamente la restricción de la helicasa in vitro mediante la evaluación de sus impactos en otras helicasas de ADN. Del mismo modo, se realizaron pruebas oficiales de ADN, ATPasa y exonucleasa WRN para identificar mezclas que obstaculizaban específicamente la acción de la helicasa WRN. También, Las mezclas inhibidoras de helicasa WRN elegidas se examinaron para descartar el compuesto de intercalación de ADN fluorescentemente dinámico Thiazole Orange para examinar la capacidad general de cada compuesto separado del NCI Diversity Set para unir el sustrato de ADN utilizado para las pruebas de helicasa WRN. Este esfuerzo ayudó a eliminar aquellos intensificadores cuyo impacto en la acción de la helicasa WRN fue intervenido por su cooperación inmediata con el sustrato de la helicasa de ADN y, de esta manera, se consideró de naturaleza vaga. Las pruebas adicionales de estructuras como NSC 19630 impulsaron la prueba distintiva de un inhibidor de helicasa WRN cada vez más fuerte asignado a NSC 617145. En los segmentos adjuntos, describiremos los métodos para estos exámenes utilizados para reconocer y describir los inhibidores de helicasa WRN NSC 19630 y NSC 617145,
El debilitamiento de la multiplicación celular y el alistamiento sólido del daño del ADN tras la introducción de células al inhibidor de helicasa WRN de una manera subordinada a WRN sugirió que un complejo ternario venenoso de ADN genómico sedado con helicasa WRN podría formarse in vivo. Aparentemente, la pequeña partícula atrapa a la WRN dinámica de helicasa en una transición clave de replicación/reparación del ADN, lo que genera un complejo dañino de cromatina que tranquiliza al ADN. Esta situación nos llevó a la especulación de que el WRN dañado avanzaría en la porción de cromatina en las células recompensadas con inhibidores de WRN. Para abordar esto para el inhibidor de WRN, las células HeLase presentaron a convergencias en expansión de NSC 617145 (0.75-2.0 μM) o el DMSO soluble en átomos pequeños (1%) durante 4 horas, seguidas por congelación celular a -80 °C y la preparación resultante de diferentes divisiones subcelulares según las propuestas del productor ( unidad de fraccionamiento de proteínas subcelulares, Thermo Scientific). Esta metodología incluye pasos básicos sucesivos para lisar células de mamíferos refinadas a la vista de una proteasa.Mezcla de inhibidores para que las divisiones atómicas solubles y unidas a la cromatina puedan separarse en 2-3 horas, abusando de la incorporación de una nucleasa microcócica asentada para liberar las proteínas unidas a la cromatina de otras proteínas atómicas. Las proteínas solubilizadas de las divisiones particulares tienen entonces una buena estructura para depositarse rápidamente en geles de poliacrilamida-SDS con inclinación desnaturalizante (4-12 %) y se analizan para determinar la proteína WRN mediante inmunotransferencia utilizando un neutralizador monoclonal de ratón WRN (1:1000; Spring Valley laboratorios). Para controlar el apilamiento, las manchas también se analizaron para las proteínas atómicas Topoisomerasa I (BD Biosciences) e Histona H3 (Abcam). Esta metodología mostró que las células HeLa presentadas a NSC 617145 mostraron un nivel más prominente de WRN endógeno en la cromatina.porción contrastada con células de control recompensadas con DMSO.
Estrategias de investigación
La letalidad diseñada genéticamente o activada sintéticamente es una forma en desarrollo de tratar los tumores diana con nuevos inhibidores de la fijación del ADN. Dado que las células malignas que se separan rápidamente agregan lesiones replicativas a un ritmo mucho más notable que las células que normalmente se separan, las células enfermas pueden ser extremadamente susceptibles a los ataques que se centran en el hardware de reparación del ADN. Nos ha entusiasmado esta idea porque las helicasas asumen funciones básicas en pasos específicos de otras vías de fijación del ADN y son necesarias para la reacción de daño del ADN. La letalidad diseñada artificialmente puede ocurrir entre un inhibidor de helicasa y un especialista que incita al daño del ADN cuando las célulasno puede soportar porciones aún más bajas del operador que daña el ADN cuando la vía subordinada a la helicasa se socava farmacológicamente. A pesar de que este resultado se puede ver cuando la helicasa funciona en una vía de corrección de ADN directamente responsable de la revisión de la lesión causada por la presentación de la célula con el operador que daña el ADN, esto puede no ser generalmente el caso. Por ejemplo, el impedimento de partículas pequeñas de una helicasa comprometida con la reacción de estrés de replicación (p. ej., WRN, RECQ1) puede actuar sinérgicamente con un operador de alquilación que presenta una llaga engorrosa que cuadra el movimiento de la horquilla. Otro componente de la letalidad diseñada artificialmente puede ocurrir cuando las célulasse presentan a un inhibidor de helicasa y un compuesto que reprime una proteína fijadora de ADN. Las dos áreas adjuntas representan pruebas basadas en células utilizadas para mostrar la letalidad fabricada de un inhibidor de helicasa WRN con un operador que daña el ADN o un inhibidor de corrección de ADN.
Conclusiones
En este artículo de Métodos, hemos retratado enfoques de prueba y metodologías que hemos utilizado para distinguir y describir inhibidores de helicasa de átomos pequeños, con énfasis en la helicasa-nucleasa WRN que es deficiente en un revoltijo monogénico de maduración acelerada conocido como condición de Werner. El método de prueba comienza con una simple pantalla in vitro para medir los efectos de las mezclas en el aflojamiento del ADN catalizado por helicasa utilizando una prueba de reubicación de cadena radiométrica, y es seguida por exámenes basados en células que utilizan un pequeño subconjunto de mezclas que se distinguen de la pantalla in vitro. . Esta estrategia fue eficaz para la revelación del principal inhibidor de la helicasa humana descrito en el escrito. Un poco de margen para esta metodología es que se puede elegir una biblioteca en la que se reconoce que las mezclas son orgánicamente dinámicas. En todo caso, hay puntos focales para realizar pantallas de alto rendimiento (normalmente fluorométricas) en bibliotecas infinitamente más grandes, incluso las que están compuestas por una gran cantidad de exacerbaciones cuya movimiento orgánico no se evaluó recientemente. Para esta situación, se podría adoptar la mejora del compuesto principal de los éxitos positivos con la plataforma científica adecuada para mejorar el compuesto en cuanto a intensidad, claridad y límites farmacológicos.
A pesar de que esta encuesta está diseñada de acuerdo con nuestros concentrados de prueba con el inhibidor de helicasa WRN, confiamos en que brinde algunas ideas de dirección y metodologías de prueba que se pueden extrapolar a numerosas helicasas, especialmente aquellas involucradas en la reacción de daño del ADN o corrección del ADN. . Los inhibidores de helicasa brindan un sistema opcional para investigar los elementos atómicos y celulares de sus objetivos y, en un grado más amplio, la compleja coordinación de cubrir y cumplir las rutas metabólicas del ADN. Además, imaginamos a las helicasas como pequeños focos de partículas apropiados que pueden mejorar las técnicas existentes contra el crecimiento maligno o desarrollarse como nuevos medicamentos reparadores aún no imaginados.