Clonación y transgénesis
Acceso abierto

abstracto

Evaluación de la formación de complejos entre la crotamina, un péptido natural que penetra en las células, y el ADN mediante un ensayo de exclusión de fluorescencia de alta sensibilidad

Baptista GR, Freitas VJF, Alcántara-Neto AS, Pereira AF y Campelo IS

La crotamina es un polipéptido catiónico natural aislado del veneno de la serpiente de cascabel sudamericana (Crotalus durissus terrificus ) capaz de formar complejos con moléculas de ADN mediante interacciones electrostáticas y translocaciones de membranas biológicas. Con tales propiedades, la crotamina puede actuar como agente de transfección para varios tipos de células pero principalmente en una etapa de proliferación. Sin embargo, para mejorar el uso biológico de este péptido, es interesante caracterizar mejor la formación y estabilidad del complejo crotamina-ADN. Por lo tanto, el presente estudio tuvo como objetivo analizar la estequiometría, la cinética de formación y la estabilidad de la proteasa del complejo crotamina-EGFP utilizando una metodología fluorescente de alta sensibilidad, basada en el ensayo de exclusión de fluoróforos. La mejor proporción de masa de ADN:crotamina para la formación de complejos oscila entre 1:10 y 1:40 como proporción de masa. En el grupo 1:10, la crotamina fue capaz de complejar alrededor del 75 % del ADN disponible tan rápido como en 20 segundos, y después de 10 minutos de reacción, la crotamina alcanzó su máxima capacidad de complejación, pudiendo complejar el 80 % de la cantidad total de ADN disponible. . En estas condiciones, hemos determinado que 1 µg de crotamina puede complejar 80 µg de ADN plasmídico circular (~4700 pb). El complejo crotamina-ADN fue resistente a la degradación de la proteinasa K incluso después de doce horas de incubación enzimática. Además, el complejo fue lo suficientemente estable para la digestión con tripsina durante un largo tiempo de incubación: más del 73 % de los condensados de crotamina-ADN mantuvieron la integridad después de 60 min, mientras que el 55 % permaneció intacto después de 180 min. Los complejos de crotamina-ADN fueron resistentes a las temperaturas fisiológicas, así como estables durante 15 días a 4 °C y durante dos meses cuando se almacenaron a -20 °C. Estos resultados nos llevan a pensar que, en las mejores condiciones de preparación aquí propuestas, los condensados de crotamina-ADN pueden utilizarse de manera eficiente y estandarizada como potencial agente de transfección en un programa de transgénesis.