Revista de Proteómica y Bioinformática
Acceso abierto

abstracto

Análisis de la interfaz de interacción proteína-proteína entre las proteínas mitocondriales de levadura Rim1 y Pif1 mediante espectrometría de masas de entrecruzamiento químico

Boris Zybailov, Kuppan Gokulan, Jadon Wiese, Ramanagouda Ramanagoudr-Bhojappa, Alicia K. Byrd, Galina Glazko, Mihir Jaiswal, Samuel Mackintosh, Kottayil I. Varughese y Kevin D. Raney

La definición de contactos proteína-proteína es un problema desafiante y el entrecruzamiento es una solución prometedora. Aquí, presentamos un caso de proteína de unión de cadena única mitocondrial Rim1 y helicasa Pif1, una interacción observada por primera vez en la inmunoafinidad desplegable de células de levadura usando cebo Pif1. Descubrimos que solo el entrecruzamiento corto de succinimidil-diazirina o formaldehído capturó la interacción entre Rim1 recombinante y Pif1. Además, era necesario despojar a Pif1 de sus dominios N-terminal y C-terminal, y el extremo C-terminal de Rim1 necesitaba modificarse para que el producto entrecruzado se volviera visible. Nuestro informe es un ejemplo de un análisis no trivial, donde una interacción estable previamente identificada escapa a la captura inicial con agentes de entrecruzamiento y requiere una modificación sustancial de las proteínas recombinantes y un ajuste fino de los métodos basados en espectrometría de masas para que los entrecruzamientos volverse detectable.

Utilizamos espectrometría de masas de alta resolución para detectar los péptidos entrecruzados. Se utilizó una mezcla 1:1 de Rim1 marcado con 15N y 14N para validar los enlaces cruzados por su cambio de masa en los perfiles de LC-MS. Se confirmaron dos sitios en Rim1: 1) el extremo N-terminal y 2) el residuo K29. Realizar el entrecruzamiento con una variante K29A redujo visiblemente el producto entrecruzado. Además, K29A-Rim1 mostró una afinidad cinco veces menor por el ADN monocatenario en comparación con Rim1 de tipo salvaje. Tanto la variante K29A como el Rim1 de tipo salvaje mostraron grados similares de estimulación de la actividad helicasa de Pif1. Proponemos modelos estructurales de la interacción Pif1-Rim1 y discutimos su significado funcional. Nuestro trabajo representa un análisis de la interfaz proteína-proteína no trivial y demuestra la utilidad de los entrecruzadores cortos y no específicos.