Revista de Oftalmología Clínica y Experimental
Acceso abierto

abstracto

Señal cromatográfica amplificada y espectroscopia de absorbancia UV para evaluar la lisozima después de la desnaturalización térmica y en extractos de lentes de contacto

Claude J Giasson, Danielle Béland y Langis Michaud

Objetivo: Amplificar la señal de absorbancia relacionada con la lisozima extraída de lentes de contacto medida por alta -cromatografía líquida de rendimiento (HPLC); examine la pureza de la lisozima y cuánto afecta la desnaturalización térmica a su perfil de elución.
Métodos: En corridas cromatográficas de prueba durante las cuales se habían inyectado extractos de lentes de contacto en el sistema, las fracciones recolectadas entre 4 y 5,5 minutos apuntaron a la lisozima como la proteína eluida según lo indicado por una transferencia Western. Las proteínas se extrajeron de lentes de contacto en una solución 50:50 de ácido trifluoroacético (TFA) al 0,2 %: acetonitrilo (ACN). Cada extracto de lente de contacto se separó en 2 alícuotas. Después de la evaporación al vacío, las alícuotas nº 1 se disolvieron en la fase móvil inicial para producir un factor de enriquecimiento de 8. Las alícuotas nº 2 se dejaron sin tratar en la solución de extracción normal. La calibración de la señal de absorbancia a 220 nm permitió medir los niveles de lisozima en los cromatogramas. Las inyecciones paralelas de ambas alícuotas en la HPLC permitieron comparar su contenido de lisozima. La pureza de la lisozima extraída se evaluó observando su espectro de absorbancia a través de los picos. Se inyectaron soluciones de lisozima previamente calentadas a 80 y 100°C y se compararon con soluciones de control. Las diferencias en el contenido mediano de lisozima entre las alícuotas n.º 1 y 2 y en el área máxima de lisozima calentada en comparación con el control se probaron con métodos no paramétricos.
Resultados: la mediana del nivel de lisozima medido en extractos enriquecidos y regulares difirió significativamente (39,8 y 21,5 µg, respectivamente). Sin embargo, una vez corregido por el diferente volumen de inyección y el factor de concentración, el nivel medio de lisozima enriquecida (21,4 µg) estuvo cerca del encontrado en el extracto regular. La observación de la absorbancia espectral sugiere que la lisozima eluida está libre de contaminantes. Las proporciones medianas de las áreas de pico de lisozima calentada sobre el área de pico de lisozima de control diferían significativamente de 1 a la temperatura de 100 °C (0,91), pero no a la de 80 °C (0,95) con la prueba de rango con signo. Incluso cuando se calentó a 80 °C, el perfil de elución de la lisozima parecía menos simétrico en comparación con el control y presentaba un punto de inflexión adicional. Estos cambios sutiles aumentaron a 100 °C.
Conclusión: El enriquecimiento de la lisozima extraída de las lentes de contacto y solubilizada en la fase móvil inicial mejora la sensibilidad de este procedimiento cromatográfico. Este protocolo cromatográfico, junto con la espectroscopia de absorbancia UV, puede detectar la desnaturalización térmica a 80 y 100 °C.