Avances en Ingeniería Genética
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abstracto

Un nuevo enfoque para introducir mutaciones puntuales específicas en el gen que codifica la distrofina: tecnología de edición PRIME

Cédric Happi Mbakam

Las mutaciones en el gen de la distrofina conducen a trastornos neuromusculares como la distrofia muscular de Duchenne, que es una enfermedad hereditaria letal ligada al cromosoma X. enfermedad con una prevalencia de 19,8 por 100 000 varones al nacer. Las terapias clínicas actualmente disponibles con corticosteroides o con inyecciones de oligómero antisentido de morfolino proporcionan una mejora fenotípica limitada. Nuestro estudio tuvo como objetivo medir la eficiencia de la tecnología PRIMEediting. Esta tecnología utiliza un plásmido editor PRIME (PE2 o PE3) que codifica una transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina Moloney fusionada con la nickasa Cas9 H840A y un plásmido que codifica un pegRNA que contiene sitios de unión de cebadores (PBS) y una plantilla de transcriptasa inversa (RTT). Permite sustituciones, deleciones o inserciones específicas de nucleótidos en el genoma. Diseñamos diferentes pegRNA dirigidos a varios hDMDexons (9, 20, 35,43, 51, 55 y 61) para introducir un codón STOP mediante la modificación de un solo nucleótido. Las células HEK293T se recogieron del medio de cultivo DMEM tres días después de haber sido transfectadas simultáneamente con PE2 y pegRNA. Los exones fueron amplificados por PCR y secuenciados utilizando el método de Sanger. Los resultados se analizaron mediante el programa EditR para estimar el porcentaje de edición. Confirmamos que la edición PRIME permite las sustituciones específicas C a T y G a T en el gen DMD con una eficiencia de edición entre 6 a 11 % (PE2) y 21 % (PE3). Las transfecciones repetidas 6 días después de la primera mostraron hasta un 15 % de edición (PE2) en los exones 9 y 35. Una mutación adicional en la secuencia PAM (exón 35) mejoró el resultado de PE2 al 38 % para una sola transfección. Por lo tanto, PRIMEediting permite las sustituciones específicas en el gen DMD y podría usarse para corregir mutaciones puntuales en el gen DMD para conducir a la expresión de distrofina.