Técnicas Avanzadas en Biología y Medicina
Acceso abierto
ISSN: 2379-1764
ISSN: 2379-1764
Elodie Rance, Jing Hu, Jerome E Tanner y Caroline Alfieri
La capacidad de resolver estructuras secundarias y terciarias, tal como están presentes en su estado nativo dentro del genoma de los virus de ARN, es un primer paso esencial para dilucidar el proceso de replicación de estos virus. El genoma del virus de la hepatitis C (VHC) está compuesto por una sola cadena (+) de ARN cuya replicación está controlada principalmente por la región no traducida 3' (3'UTR). La 3'UTR comprende una región variable específica del genotipo (VR), una repetición poli (U/UC) y una secuencia de 98 bases conservada llamada X-tail. Aunque se han propuesto modelos estructurales de la 3'UTR a partir de análisis bioquímicos in vitro, su estructura nativa como parte del genoma viral de longitud completa que existe dentro del entorno intracelular es incierta. Como un medio para mapear las estructuras nativas de ARN de doble cadena (ds) y de una sola cadena (ss) contenidas en el 3'UTR del genoma de longitud completa, realizamos un etiquetado químico in situ en combinación con RT-qPCR dirigida al sitio. Los resultados indican que el ssRNA predomina en las secuencias repetidas VR-poly (U/UC), mientras que los elementos dsRNA están restringidos a la cola X. El etiquetado químico in situ también identificó un elemento dsRNA único ubicado en la región de repetición VR-poly (U/UC) comprendida en parte de las secuencias ubicadas fuera de la 3'UTR. Los resultados descritos aquí constituyen un primer informe para el sondeo in situ y la detección de estructuras secundarias presentes en la secuencia 3'UTR del genoma del VHC. El uso de agentes modificadores de ARN intracelular para demarcar dsRNA y ssRNA, en combinación con PCR para amplificar cantidades traza del ARN objetivo, tiene una aplicación potencial en el mapeo de estructuras secundarias nativas dentro de ARN intracelulares complejos.