Revista de métodos de diagnóstico médico
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abstracto

Ensayos de exclusión de colorantes de dos pasos específicos de espermatozoides para evaluar la integridad de las membranas plasmáticas y de orgánulos: nuevo enfoque para garantizar la calidad de los espermatozoides para la inyección intracitoplasmática de espermatozoides

Satoru Kaneko, Yuki Okada, Kiyoshi Takamatsu

Objetivo: Las evaluaciones integrales de las membranas plasmáticas y de los orgánulos son un nuevo enfoque para comprender la fertilidad de los espermatozoides humanos. El presente estudio desarrolló dos tipos de ensayos de exclusión de colorantes de dos pasos específicos de los espermatozoides para evaluar las membranas plasmáticas y de los orgánulos en los espermatozoides humanos.

Métodos: Ensayo de exclusión de colorante de 2 pasos específico de esperma: El esperma se incubó con rojo reactivo 195 (RR195) o concanavalina A conjugada con Cy3 (Cy3-con A) en un medio de cultivo isotónico, se contratiñeron con azul reactivo 222 o concanavalina A conjugada con Alexa 488 después de la exclusión de la membrana plasmática con metanol, respectivamente. La integridad de la membrana del orgánulo en las mitocondrias se observó mediante la retención de Mito Tracker FM. El cellROX Orange produjo fluorescencia naranja tras la oxidación por especies reactivas de oxígeno reaccionadas.

Resultados: El ensayo de exclusión de colorante de 2 pasos específico de espermatozoides se compone de la permeación y unión del primer colorante a los núcleos a través de las membranas plasmática y de los orgánulos dañados; después de la exclusión de la membrana, los núcleos recién expuestos o la membrana acrosómica interna se contratiñeron con el segundo colorante. Las membranas plasmática y acrosómica intactas en espermatozoides humanos móviles (espermatozoides vivos; LS) excluyeron RR195 y Cy3-con A, pero aquellos desnaturalizados permitieron la permeación. Los LS colorearon azul o produjeron fluorescencia verde, por un lado, los desnaturalizados produjeron fluorescencia roja o roja, respectivamente. La fluorescencia de Mito Tracker FM y cellROX Orange en las mitocondrias certificó la normalidad de la fosforilación oxidativa en las mitocondrias con membrana de orgánulo intacta. El ensayo de exclusión de RR195 de un solo paso derivado es un candidato viable para la evaluación no destructiva intraoperatoria de los espermatozoides móviles en la ICSI clínica.

Conclusión: Los ensayos de exclusión y retención de colorante contribuyen a las evaluaciones preoperatorias de las cualidades de los espermatozoides y el ensayo de exclusión de colorante de un solo paso modificado puede ser útil para la selección intraoperatoria de espermatozoides en la inyección intracitoplasmática clínica de espermatozoides, respectivamente.