Clonación y transgénesis
Acceso abierto

abstracto

Sobreexpresión mediada por lentivirus de NGF en células madre derivadas de tejido adiposo

Akram Alizadeh, Mansoureh Soleimani, Jafar Ai, Ali Fallah, Seyed Jafar Hashemian, Hajar Estiri, Mohammad Reza Nourani y Seyed Nasser Ostad

Introducción: Las células madre derivadas de tejido adiposo humano (ADSC, por sus siglas en inglés) son células madre multipotentes que pueden autorrenovarse y diferenciarse en varios tipos de células tales como adipocitos, osteocitos y células neurales. Estas células madre pueden aislarse mediante técnicas mínimamente invasivas en grandes cantidades. Las ADSC son un recurso útil para la terapia celular y la medicina regenerativa. El factor de crecimiento nervioso (NGF) es el primer factor de neurotrofina descubierto y caracterizado por su función antiapoptótica en el desarrollo neuronal. NGF puede promover la supervivencia neuronal y el crecimiento de neuritas y también promueve la diferenciación y migración de neuronas. Además, la investigación demostró que el NGF podría proteger los axones del daño inflamatorio, mejorar la función cognitiva en modelos cerebrales dañados y funcionar en la prevención y el tratamiento de enfermedades neurológicas como la enfermedad de Alzheimer. En este estudio, utilizamos la técnica de transferencia de genes mediada por vectores lentivirales para administrar el gen NGF a las ADSC y sobreexpresar este factor en las ADSC.

Método y materiales: ADSCs extraídas de tejido adiposo humano tras lipoaspiración por método de digestión. ADSC caracterizadas con citometría de flujo y ensayo de diferenciación en medios diferenciales adipogénicos y osteogénicos. El gen NGF se clonó en pCDH-513B-1 (System Bioscience, Mountain View, CA, Estados Unidos) bajo un promotor de citomegalovirus (CMV). Los lentivirus recombinantes se produjeron de acuerdo con el protocolo de laboratorio del Prof. Trono con algunas modificaciones en células HEK 293T. El método de spinfection se utilizó para transducir ADSC. La expresión de NGF se analizó utilizando un microscopio fluorescente para rastrear el marcador de proteína fluorescente verde (GFP), RT-PCR y transferencia Western.

Resultados: Las ADSC extraídas tenían morfología mesenquimatosa y se diferenciaron en adipocitos y osteocitos en medios de diferenciación. HEK293T se transfectó fácilmente con pCDH-513B-1 y más del 99 % expresó GFP, por lo que recolectamos pseudovirus del sobrenadante. Las ADSC transducidas con estos pseudovirus transfirieron NGF y, después de la transducción, expresaron GFP, como se observa bajo el microscopio fluorescente. RT-PCR y western blotting verificaron la sobreexpresión de NGF en ellos.

Conclusión: las ADSC se pueden transducir con pseudolentivirus que transfieren NGF, lo que conduce a una sobreexpresión de NGF.